QuEChERS前處理結合HPLC-MS/MS同時測定原料乳中30種獸藥殘留

李婧妍，韓波，安樂，張瑞雪

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，農業農村部食品質量監督檢驗測試中心（楊凌），陜西 楊凌 712100）

原料乳通常是從奶牛乳房擠出來未經過處理的生牛乳，優質、安全的原料乳供應是現代乳業健康發展的重要保障。為促進奶牛生長、防止各類疾病、降低死亡率，獸藥被廣泛應用于奶牛養殖[1-2]。但由于獸藥使用過程中濫用、誤用以及不遵守休藥期等現象屢禁不止，導致過量的獸藥在牛奶中蓄積與殘留，當殘留量超過一定限度時，會對人體造成潛在的危害[3-5]。GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》里明確規定了不得檢出的獸藥清單和禁用且不得檢出的獸藥清單，其中β-激動劑類、磺胺類和喹諾酮類獸藥是我國畜禽產品重點監控項目，也是我國農業部門和市場監管部門執行畜禽產品質量安全例行監測項目中主要監測指標。

高效液相色譜-串聯質譜技術（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）廣泛應用于獸藥殘留的檢測，該方法通過保留時間、特征離子以及離子對豐度比進行定性、定量分析，方法專屬性強、靈敏度高。獸藥殘留檢測中應用較多的前處理技術有液液萃取[6]、固相萃取[7]、加速溶劑萃取[8]、鹽析液相萃取法[9]、分散固相萃取[10]等。這些方法前處理過程復雜，大多需經過提取、凈化、濃縮等步驟，且消耗耗材多、試驗周期長、方法靈敏度低。快速、簡便、低價、有效、穩定、安全（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe，QuEChERS）提取法具有高通量、試劑消耗少、成本低、環境友好的優勢，可同時檢測多種類藥物，被廣泛應用于農產品和畜禽產品中多藥物殘留檢測。在乳制品獸藥殘留檢測中，QuEChERS提取法已應用于大環內酯類、喹諾酮類、磺胺類、胺酰醇類等獸藥的檢測[11-12]，但檢測對象多為單一類獸藥，且沒有同時檢測β-激動劑類、磺胺類和喹諾酮類獸藥的研究方法。

QuEChERS提取法用于原料乳中多種類獸藥殘留的檢測存在兩個關鍵問題：原料乳基質成分復雜，乳蛋白、乳脂肪、乳糖以及維生素和礦物元素等因素對獸藥殘留定量產生干擾[13]；另外，原料乳中同時存在脂溶性和非極性獸藥，而非極性獸藥又易與乳脂肪結合，導致獸藥提取難度增大，因此建立適宜的樣品提取方法對定量檢測至關重要。本文以原料乳為研究對象，通過考察提取溶劑、提取方法、凈化劑組成及配比對目標獸藥回收率的影響，建立QuEChERS提取法結合HPLC-MS/MS同時測定原料乳中β-激動劑類、磺胺類和喹諾酮類獸藥的分析方法，可在1個試驗周期內同時檢測樣品中30種獸藥殘留，降低了檢測成本，縮短了檢測時間，對原料乳的質量安全控制具有較高的實用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

LC-2010A高效液相色譜：日本島津公司；AB 4000 Q-Trap串聯質譜儀：美國SCIEX公司；電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）、MS3 型渦旋振蕩器：德國IKA公司；Allegra 64R高速冷凍離心機：美國Beckman公司；xs105DU十萬分之一分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；DCY-III氮吹水浴濃縮儀：北京金科精華苑技術研究所；Milli-Q超純水儀：美國Millipore公司。

1.2 材料與試劑

克倫特羅（clenbuterol，CLE）、沙丁胺醇（salbutamol，SAL）、萊克多巴胺（ractopamine，RAC）、特布他林（terbutaline，TER）、西馬特羅（cimaterol，CIM）、非諾特羅（fenoterol，FEN）、氯丙那林（clorprenaline，CLO）、妥布特羅（tulobuterol，TUL）、噴布特羅（penbuterol，PEN）標準品（純度均≥99%）：美國Sigma-Aldrich公司；丹諾沙星（danofloxacin，DAN）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、依諾沙星（enoxacin，ENO）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、雙氟沙星（difloxacin，DIF）、磺胺醋酰（sulfacetamide，SAA）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathiazole，STZ）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SP）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SM）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SMZ）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，SMT）、磺胺對甲氧嘧啶（sulfameter，SME）、磺胺氯噠嗪（sulfachloropyrida，SCP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadoxine，SDO）、磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole，SMX）、磺胺二甲基異噁唑（sulfisoxazole，SIX）標準品（純度均≥99%）：德國Dr Ehrenstorfer公司；十八烷基硅烷（n-octadecylsilane，C18）、N-丙基乙二胺 （primary-secondary amine，PSA）、氨基（amino，NH2）凈化劑：天津博納艾杰爾公司；乙腈（acetonitrile，ACN）、甲醇（均為色譜純）：美國天地有限公司；甲酸、MgSO4、Na2SO4、NaCl、Na2HPO4、檸檬酸、EDTA-2Na·2H2O（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；試驗所用原料乳購自于陜西西安、咸陽和寶雞等地區奶牛養殖場。pH4.0的乙二胺四乙酸-Mcllvaine（ethylene diamine tetraacetic acid-Mcllvaine，EDTA-Mcllvaine）0.1 mol/L緩沖液通過以下方法制備：準確稱取10.9 g Na2HPO4、37.2 g EDTA二鈉鹽和12.9 g一水檸檬酸用超水溶解，定容至1.0 L。

1.3 色譜和質譜分析條件

LC-2010A高效液相色譜儀配備Shim-pack XRODS（I.D.3.0 mm × 75 mm，2.2 μm）色譜柱；流動相 A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈。流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL。AB 4000 Q-Trap串聯質譜儀，配備ESI多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）正離子掃描模式，離子源溫度：550℃；電噴霧電壓：5 000 V；氣簾氣電壓：69 kPa；噴霧氣壓力：345 kPa；輔助氣壓力：345 kPa條件下，依次進行一級和二級質譜掃描，確定母離子、定量子離子和定性子離子，在多反應監測模式下對質譜參數，如去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞電壓（collision energy，CE）等進行優化。

1.4 標準溶液配制

準確稱取所有標準品各100 mg（精確至0.01 mg），置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，即為濃度1.0 mg/mL的標準儲備液，-20℃避光儲存3個月。吸取1mL上述溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，配制為濃度10 μg/mL的中間工作液（5℃避光儲存2周）。吸取上述溶液10 mL加入到100 mL容量瓶中，用乙腈溶液稀釋至刻度，即為30種獸藥濃度均為1.0 μg/mL的混合標準溶液（保質期為1周）。

1.5 原料乳的前處理方法

準確稱取10 g原料乳（精確到0.01g）置于50 mL具塞離心管中，加入8 mL乙腈、2 mL 0.1 mol/L EDTAMcllvaine和0.1 mL乙酸，渦旋振蕩2 min，樣品和溶劑完全混合后，加入2 g NaCl和2 g Na2SO4繼續渦旋振蕩1 min，以10 000 r/min離心5 min，取4 mL上層乙腈相，加入100 mg C18和100 mg PSA凈化劑，渦旋振蕩1 min，50℃水浴氮氣吹干后，殘渣用1.0mL10%水乙腈溶液復溶，溶液過0.22 μm有機濾膜至進樣瓶中，供HPLC-MS/MS分析。

1.6 基質效應和基質標準曲線制備

基質效應（matrix effect，ME）用加標量為 10 μg/kg的空白樣品峰面積（Am）和溶劑標峰面積（Ai）計算，重復3次，計算公式如下。

以空白樣品提取液作為標準溶液的稀釋液，配制濃度分別為0.5 μg/kg～100.0 μg/kg的基質標準曲線。以各組分濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制基質標準曲線。

1.7 方法回收率及檢出限和定量限測定

稱取待測樣品10 g，加入適量的混合標準溶液，配制成30種獸藥加標量分別為5.0、10.0、20.0 μg/kg 3個濃度的加標樣品，每個濃度平行測定3份樣品，計算批內和批間回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分別通過加標樣品（10 μg/kg）3倍和10倍信噪比計算。

1.8 數據處理

色譜數據分析采用AB 4000 Q-Trap Analyst軟件進行處理，回收率和精密度試驗數據由Office Excel軟件處理，統計圖采用Origin Pro 8.5制作。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

30種目標獸藥經質譜優化得到的最佳參數見表1。

表1 30種獸藥的多反應監測參數Table 1 MRM parameters for the 30 veterinary drugs

2.2 色譜條件的優化

30種獸藥經液相色譜條件優化得到的總離子流圖見圖1。

圖1 原料乳中30種獸藥的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the 30 veterinary drugs in raw milk

由圖1可知，以乙腈為有機相時，目標物離子化效率和靈敏度高，峰行對稱且較窄、分離效果普遍較好。采用甲醇為有機相時，色譜峰形不對稱，出現拖尾。當水相中不添加甲酸時，喹諾酮類獸藥存在拖尾現象。添加0.1%甲酸后，峰形得到明顯改善。這是因為喹諾酮類獸藥極性較大，且該類化合物中含有羧酸和哌嗪基，屬于酸堿兩性化合物，色譜峰容易拖尾，而以酸性溶液作為流動相可改善拖尾現象。對色譜梯度洗脫程序進行優化，反復試驗后確定為0～7.0 min，90%A～60%A；7.0 min～20.0 min，10%A ；20.0 min～20.1 min，10%A～90%A，保持到 34.0 min。

2.3 提取條件優化

在QuEChERS前處理方法中，乙腈是提取獸藥殘留常用試劑，具有良好的蛋白沉淀作用。考慮到喹諾酮類（羧基和氨基）獸藥為兩性物質，酸性環境離子化程度高[14]，并且磺胺類獸藥在酸化乙腈中具有較好的溶解性[15-16]，因此本研究以1.0%乙酸乙腈為提取劑，考察不同體積比（9∶1、8∶2、7∶3）乙酸乙腈與 EDTA-Mcllvaine緩沖液對30種獸藥提取效果的影響，結果見圖2。

圖2 提取液比例對30種獸藥回收率的影響Fig.2 Effect of extracting solutions rate on recoveries of the 30 veterinary drugs

由圖2可知，當乙酸乙腈和EDTA-Mcllvaine緩沖液體積比為8∶2時，目標獸藥的提取效率最高，獸藥回收率均在70.6%～96.3%之間。不同體積比（9∶1、8 ∶2、7∶3）乙酸乙腈和 EDTA-Mcllvaine緩沖液對喹諾酮類獸藥影響較大，當提取液中EDTA-Mcllvaine緩沖液含量較低時，原料乳中存在鈣、鎂等礦物元素，會與喹諾酮類化合物發生一定的螯合反應，導致回收率降低。加入體積比為8∶2的乙酸乙腈和EDTAMcllvaine緩沖液可絡合乳中的鈣鎂離子，使喹諾酮保持溶解狀態，從而提高提取率[17]。

2.4 鹽析劑和脫水劑條件優化

NaCl、Na2SO4、MgSO4是 QuEChERS 方法中常用的鹽析劑和脫水劑[11，18]，試驗分別對比了NaCl和 Na2SO4、NaCl和MgSO4對各類獸藥回收率的影響。當選用NaCl和MgSO4作為鹽析劑時，喹諾酮類和磺胺類獸藥的回收率有不同程度降低，最高降低幅度達到30%。這是因為喹諾酮類獸藥易與Mg2+形成螯合物導致溶解度降低。當選用NaCl和MgSO4時，回收率明顯提高，因此本試驗選用NaCl作為鹽析劑、Na2SO4作為脫水劑。

2.5 凈化劑條件優化

液態乳基質中存在脂肪、蛋白、乳糖、維生素和礦物質等雜質，因此凈化劑的選擇既要能有效除去乳中雜質，又不會吸附目標物。試驗比較了不同含量（50、100、200 mg）C18、PSA和NH23種凈化劑的凈化效果，結果分別見圖3。

圖3 C18、NH2和PSA凈化劑對30種獸藥回收率的影響Fig.3 Influence of C18，NH2and PSA sorbents on the recovery of the 30 veterinary

由圖3可知，使用NH2為凈化劑時，喹諾酮和磺胺類獸藥回收率為30%～60%，說明該凈化劑對目標物產生了吸附作用。PSA具有良好的吸附糖類、脂肪酸和其他極性有機酸作用[19]，當使用100 mg PSA作為凈化劑時，除了 TUL（49.6%）、SD（45.2%）、SP（46.5%）、SDO（45.4%），其他獸藥的回收率為50.8%～89.7%。C18主要吸附非極性物質[20]，凈化乳脂肪效果較好，但C18凈化劑用量為100 mg時，β-激動劑類獸藥的回收率低于70%。考慮到兩種凈化劑在凈化效果方面的互補性，試驗進一步考察C18和PSA兩種凈化劑組合使用對獸藥回收率的影響，當C18和PSA用量為100 mg時，獸藥回收率可達到70%以上，隨著PSA和C18用量的增加，回收率降低。綜合考慮凈化效果和方法回收率，最終確定100 mg C18和100 mg PSA作為混合凈化吸附劑。

2.6 基質效應評價

在最佳凈化條件下，對30種目標物的基質效應進行了評價，結果如圖4所示。

圖4 基質效應Fig.4 Matrix effect

由圖4可知，12種目標物顯示了基質抑制效應，ME為65.4%～99.0%，其中SAR（65.0%）、PEF（69.7%）、RAC（65.4%）和SDO（67.9%）存在明顯的抑制效應。其他18種目標物ME為100%～160%，其中FEN（140.2%）和SAA（130.3%）存在明顯的基質增強效應。基質效應是由樣品基質中的共體干擾物與目標化合物競爭電離所致，導致目標成分在離子化時受到樣品基質中某些成分的影響而引起分析信號改變，與目標物濃度、提取方法以及離子化程度關，且基質效應的變化有不確定因素[13]。為使定量分析結果準確可靠，本試驗采用基質匹配標準溶液作為校準曲線以降低基質效應對結果準確性的影響。

2.7 方法有效性

方法有效性依據歐盟規定2002/657/EC對線性回歸、回收率、重復性（批內精密度）和再現性（批間精密度）、LOD和LOQ進行評價，結果見表2。

表2 30種獸藥的線性方程、線性范圍、相關系數（r）、回收率、檢出限、定量限、批內和批間精密度Table 2 Linear range，linear equations，correlation coefficient（r），recovery，LOD，LOQ ，intra-precision and inter-precision of 30 veterinary drugs

由表 2 可知，30 種化合物在 0.5 μg/kg～100.0 μg/kg的質量濃度范圍內線性關系良好，線性相關系數（r）均大于 0.99。目標化合物的檢出限為 0.10 μg/kg～1.21 μg/kg，定量限為 0.40 μg/kg～4.05 μg/kg，這個結果與國家標準方法和其他研究相比相近似或更低[21-22]。試驗選擇陰性樣品添加3個濃度水平（5.0、10.0、20.0 μg/kg）混合物標準溶液，每個濃度加標水平做6個平行樣，考察方法回收率和精密度。30種目標化合物的回收率為71.1%～94.8%，RSD低于12.2%。

2.8 實際樣品分析

采用本方法對陜西西安、咸陽和寶雞地區農戶的50份原料乳樣本進行了測定，所測原料乳中發現一個樣品中氧氟沙星含量為3.5 μg/kg，另一個樣品中恩諾沙星含量為 2.47 μg/kg。

3 結論

本文采用QuEChERS前處理結合HPLC-MS/MS技術，通過優化色譜質譜條件、提取條件和凈化條件，建立了快速測定原料乳中30種獸藥殘留的分析方法。與傳統獸藥提取前處理方法相比，本方法具有前處理簡單快捷、有機溶劑用量少、靈敏度高等優點，且該方法成功用于實際樣品的測定，可作為原料乳中獸藥的定性定量檢測手段，對原料乳中獸藥殘留情況的監測具有重要的用應用價值。