病毒性毛細支氣管炎患兒血清白細胞介素-6、酪氨酸激酶/信號傳導及轉錄激活因子信號通路與免疫功能的關系

王雅寧, 崔立業, 陳翼霖, 賈宏超

(1. 河北省保定市第一中心醫院東院 檢驗科, 河北 保定, 071000;2. 河北省保定市中心血站 檢驗科, 河北 保定, 071000; 3. 河北省望都縣醫院 檢驗科, 河北 保定, 071003)

毛細支氣管炎是臨床常見的以嬰幼兒為發病高峰的呼吸道感染性疾病，多由病毒感染引起，早期治療不及時可遷延發展，并與成年哮喘有緊密聯系[1]。臨床治療以抗病毒、抗感染、營養支持、霧化吸入以及對癥處理為主，目前缺乏更高效的干預靶點，究其原因為疾病發生的確切機制仍不十分清楚。既往研究[2-3]提出，機體防御機制不完善、早產、人工喂養、環境刺激、發育異常、病毒感染、炎癥反應等均可能參與了毛細支氣管炎的發生和發展過程，但是缺乏統一認識，還有待進一步探討。近期研究[4-5]發現，由病毒感染誘發機體炎癥反應紊亂和免疫功能障礙可能在毛細支氣管炎的發生以及疾病轉歸中扮演重要角色。白細胞介素(IL)-6作為機體重要的促炎介質，在介導瀑布樣炎癥級聯反應中發揮關鍵作用[6]。同時，細胞內酪氨酸激酶/信號傳導及轉錄激活因子(JAK/STAT)信號通路可能是IL-6發揮促炎作用的重要“橋梁”[7], 但目前還缺乏此方面的基礎和臨床研究。因此，本研究以收治的病毒性毛細支氣管炎患兒為研究對象，探討患兒外周血清IL-6和JAK/STAT信號通路分子的表達以及免疫功能變化的臨床意義，為疾病治療新靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用隨機法選擇2019年9月—2021年3月入院首次確診為病毒性毛細支氣管炎的患兒112例為研究對象，其中輕度50例(輕度組)、中度40例(中度組)、重度22例(重度組)。呼吸危重評定量表評分<4分為輕度, 4～8分為中度, >8分為重度[8]。納入標準: ① 年齡>1個月者; ② 符合毛細支氣管炎的診斷標準[8]者，血清病毒抗原和病原學檢測符合病毒感染的證據，如呼吸道合胞病毒; ③ 病程<7 d者; ④ 患兒經臨床治療均康復出院。排除標準: ① 患兒先天發育異常、圍產期并發癥、免疫功能障礙; ② 抽血困難患兒。另外選擇30例健康兒童作為對照組。該研究取得受試者監護人的知情同意和醫學倫理審批。輕度組男28例，女22例; 年齡5個月～3歲，中位年齡1.8歲; 體質量6～14 kg, 平均(10.5±3.6) kg。中度組男22例，女18例; 年齡3個月～4歲，中位年齡1.6歲; 體質量4～19 kg, 平均(11.6±3.9) kg。重度組男12例，女10例; 年齡4個月～3.5歲，中位年齡1.5歲; 體質量4.6～17.0 kg, 平均(10.7±3.7) kg。對照組男16例，女14例; 年齡5個月～3.5歲，中位年齡1.9歲; 體質量6.5～20.0 kg, 平均(12.2±4.2) kg。各組性別、年齡和體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

毛細支氣管炎患兒入院24 h內用藥，治療前抽取外周靜脈血5 mL, 對照組抽取空腹外周靜脈血5 mL, 經室溫靜置后以2 000轉/min離心10 min, 分別分裝上清液和下層細胞沉淀，于-80 ℃保存集中送檢。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-6, Western blot法檢測外周血單個核細胞(PBMCs)中磷酸化酪氨酸激酶 (p-JAK)、磷酸化信號轉導激活轉錄因子 (p-STAT)蛋白相對表達量，免疫透射比濁法檢測血清免疫球蛋白(Ig)A(IgA)、IgG和IgM, 流式細胞術檢測CD4+和CD8+百分比。IL-6試劑盒購自美國Sigma公司, IgA、IgG和IgM試劑盒購自美國Beckman Coulter公司，流式細胞儀購自美國BD公司，根據說明書步驟進行，同批次試劑間變異以及不同批次間變異度均小于10%。每例樣本均分別獨立檢測3次，結果取平均值。由副高以上專職人員獨立完成。

PBMCs采用密度梯度離心法進行層析、分離并提純，加入含胎牛血清的RPMI-1640液重懸，調整細胞濃度為1×106個/mL; 然后接種于6孔板上，每孔1 mL, 每組設置3個復孔; 將細胞培養板置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養6 h, 結束后用PBS液洗滌2次，每次10 min; 每孔加入200 μL蛋白裂解液置于冰上孵育，然后12 000轉/min離心30 min得到上清液即總蛋白。取10 μL樣品蛋白加入PBS液稀釋至總體積100 μL, 調整終濃度為0.5 mg/mL; 向酶標孔中加入BCA工作液200 μL搖勻靜置30 min; 然后1 h內在酶標儀上測定吸光度值，繪制標準曲線并計算蛋白濃度。根據電白電泳程序完成蛋白電泳、帶電轉膜、封閉抗體，滴加兔抗人p-JAK和p-STAT一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后滴加羊抗兔二抗室溫下孵育1 h; 最后加入顯色液顯影，拍照保存，以目標蛋白與內參蛋白β-actin電泳條帶的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量，采用Image J軟件自動分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行處理，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩組間比較采用LSD-t法檢驗; 計數資料的比較采用χ2檢驗;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IL-6、p-JAK和p-STAT比較

與對照組比較，輕度組、中度組和重度組IL-6、p-JAK和p-STAT升高，差異有統計學意義(P<0.05); 重度組IL-6、p-JAK和p-STAT水平高于輕度組、中度組，差異有統計學意義(P<0.05); 輕度組和中度組上述指標比較，差異無統計學意義(P>0.05), 見表1。

表1 各組IL-6、p-JAK和p-STAT比較

2.2 IgA、IgG和IgM比較

與對照組比較，輕度組、中度組和重度組的IgA、IgG和IgM水平較低，差異有統計學意義(P<0.05); 與輕度組、中度組比較，重度組IgA、IgG和IgM水平降低，差異有統計學意義(P<0.05); 輕度組、中度組患兒上述指標差異無統計學意義(P>0.05), 見表2。

g/L

2.3 CD4+和CD8+百分比及CD4+/CD8+比較

與對照組比較，輕度組、中度組和重度組CD4+和CD8+百分比降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與輕度組、中度組比較，重度組CD4+和CD8+百分比降低，差異有統計學意義(P<0.05); 輕度組、中度組CD4+和CD8+百分比比較，差異無統計學意義(P>0.05)。各組間CD4+/CD8+比較，差異均無統計學意義(P>0.05), 見表3。

表3 各組CD4+和CD8+百分比及CD4+/CD8+比較

3 討 論

毛細支氣管炎的主要臨床表現是喘憋和呼吸困難，病理顯示其多累及肺泡和肺泡間質，也被稱為喘憋性肺炎[9]。致病菌以呼吸道合胞病毒最常見，臨床治療以解除氣管痙攣為主，治療不及時極易形成重癥肺炎、心力衰竭等嚴重并發癥，危及患兒生命[10]。

本研究顯示，輕度組、中度組IL-6、p-JAK和p-STAT表達高于對照組，重度組高于輕度組、中度組，提示IL-6和JAK/STAT信號通路激活可能參與了毛細支氣管炎的發生和發展。但是，本研究不能明確IL-6和JAK/STAT是促進毛細支氣管炎發生的前提，還是疾病發生過程中的一種表現，下一步可以通過復制毛細支氣管炎動物模型來分析內在作用機制。BERTRAND P等[11]通過提取毛細支氣管炎患兒的鼻咽抽吸物和支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測發現, BALF中Th2細胞因子(IL-3、IL-4、IL-10和IL-13)、促炎細胞因子和趨化因子[IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)和IL-8]水平高于對照組，并且IL-3和IL-12水平升高與反復喘息的發生有直接關系。BELACHEW N等[12]研究也表明，閉塞性細支氣管炎(BO)患者的肺功能參數中用力肺活量、第1 秒用力呼氣量、25%肺活量時最大呼氣流速明顯降低，肺清除指數顯著高于健康對照組，除了總細胞和中性粒細胞數量增加引起的大量氣道炎癥外, IL-6和IL-8水平也顯著升高，上述研究均提示，以ILs為核心的炎癥反應在毛細支氣管炎的發生中發揮重要作用。IL-6是十分重要的前沿促炎因子，不僅可以大量招募白細胞、肥大細胞、單核巨噬細胞以及淋巴細胞向氣道感染處聚集，而且可以進一步刺激炎癥細胞大量釋放CRP等炎癥介質，誘導機體炎癥不斷升級，使疾病早期快速擴散，加快疾病進展[13-15]。

DONG M等[16]研究發現，在BO中miR-27a-3p的潛在作用靶點有Smad2和sprouty2, 并且可間接激活樹突狀細胞(DC)中的細胞外調節蛋白激酶(ERK), 增加IL-10的表達，進而通過正反饋環路即IL-10/JAK/STAT3途徑維持DCs的未成熟狀態，引起Foxp3+CD4+T細胞數量和轉化生長因子(TGF)-β水平的增加。ZHU Z Z等[17]進行了一項多中心前瞻性隊列研究，對毛細支氣管炎患兒進行鼻咽氣道代謝譜分析，證實毛細支氣管炎是一種高度異質性疾病，與5歲時患哮喘風險有一定的縱向關系。

本研究顯示，與對照組比較，輕度組、中度組和重度組CD4+和CD8+百分比降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與輕度組、中度組比較，重度組CD4+和CD8+百分比降低，差異有統計學意義(P<0.05)。以上研究結果提示，毛細支氣管炎患兒存在明顯的體液和細胞免疫功能下降。PBMCs富含淋巴細胞和自然殺傷細胞，是參與機體免疫應答的重要細胞類型[18-19]。呼吸道病毒入侵并定植于氣道上皮黏膜后，單核-巨噬細胞系統通過表面識別受體與病毒配體進行特異性結合，進而啟動以體液和細胞免疫為主的主動應答過程[20-21]。單核-巨噬細胞表面可大量表達IL-6受體，與細胞外IL-6配對特異性結合，進而激活細胞內JAK/STAT信號通路，調節免疫細胞功能[22]。

綜上所述，病毒性毛細支氣管炎患兒體內IL-6高表達和JAK/STAT信號通路激活可能參與了病毒性毛細支氣管炎的發生和發展，并與患兒的體液和細胞免疫功能紊亂密切相關，因此可為未來尋找疾病治療新的干預靶點提供理論參考依據。