自體外周血單個核細胞移植術(shù)治療難治性重度肢體缺血性疾病的療效預(yù)測性研究

邵華 孫英倫 李斌 霍楠楠 辛明霞 王寒

大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院血管外科 大連 116021

重度肢體缺血(Critical limb ischemia, CLI)是外周血管疾病(peripheral arterial disease, PAD)的晚期階段，其中又以難治性CLI (no-option CLI, NO-CLI)最為嚴重。研究表明，患者6個月內(nèi)踝上截肢率和病死率分別高達40%和20%[1-2]。針對無法手術(shù)重建血運的NO-CLI患者，大量國內(nèi)外研究證明自體外周血單個核細胞(PBMNCs)移植術(shù)安全、可行[3-6]，但部分患者對治療無應(yīng)答或預(yù)后不佳[7-8]。基于此，如可確立影響無應(yīng)答患者的獨立危險因素并制定出預(yù)測療效的評判指標，將對NO-CLI患者的治療有很大的幫助。本研究對我院血管外科2015-12—2018-10行自體PBMNCs移植術(shù)的40例(40條患肢) NO-CLI患者的臨床資料進行回顧性分析，旨在探討自體PBMNCs移植術(shù)的療效預(yù)測及評判指標，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性分析在我院行自體PBMNCs移植術(shù)的40例NO-CLI患者的臨床資料。納入標準：(1)18～80歲。(2)影像學(xué)檢查(CTA、MRA、DSA)結(jié)果明確為肢體血管狹窄或閉塞性病變者。(3)肢體有靜息痛、潰瘍或壞死 (Fontaine 3～4期)。(4)血管條件不適合開放手術(shù)及腔內(nèi)治療，或曾接受上述治療方法3個月后未見好轉(zhuǎn)的患者。(5)規(guī)范化藥物治療至少1個月，靜息疼痛未見好轉(zhuǎn)者。(6)接受規(guī)范治療1個月以上潰瘍或壞疽無愈合趨勢者。(7)具有完整基線資料；接受自體PBMNCs移植治療且有至少6個月的完整隨訪資料；同時符合第1、2、3、4、7條標準并符合第5、6條中至少一條。排除標準：(1)治療前3個月內(nèi)出現(xiàn)心肌梗死、腦梗死、肺栓塞、肝功能重度異常等嚴重不良事件者。(2)治療前1 a 內(nèi)有惡性腫瘤病史或術(shù)前檢查懷疑合并惡性腫瘤者。共36例(36條患肢)符合入組標準。全部患者入院后經(jīng)過解痙、擴血管、抗血小板聚集、活血化瘀等藥物治療效果不佳，選擇采用自體PBMNCs移植術(shù)治療。采用公認的Fontaine分期法評估肢體缺血程度，其中Ⅲ期患者24例，Ⅳ期患者12例。

1.2方法

1.2.1 信息采集方法 (1)一般特征。(2)患側(cè)肢體信息。(3)病因。(4)既往史。(5)術(shù)前檢查及化驗結(jié)果。(6)移植物信息。

1.2.2 自體PBMNCs移植術(shù) (1)骨髓動員：完善術(shù)前檢查，連續(xù)5 d皮下注射G-CSF， 5μg·kg-1·d-1，依諾肝素1 mg·kg-1·d-1。(2)每日晨行血常規(guī)檢測，觀察白細胞和CD34+細胞計數(shù)；若在使用G-CSF過程當(dāng)中，白細胞計數(shù)>60×109/L，則調(diào)整G-CSF劑量或立即進行血漿分離。(3)動員后第5天進行血漿分離置換；并測定初始分離產(chǎn)物中白細胞濃度、白細胞分類和CD34+細胞濃度。(4)移植物質(zhì)量要求：嚴格保證移植物無菌，CD34+細胞劑量范圍于1×105～1×106/kg。(5)手術(shù)：在全麻下采用肌內(nèi)注射的方式，注射到患側(cè)小腿和足部，每點注射0.5 mL，直至達到目標劑量，注射點的間隔視移植物體積而定。若肢體組織損傷合并創(chuàng)面感染的患者，予以同期清創(chuàng)或者截趾術(shù)。

1.3觀察指標(1) 移植6個月后脫離CLI狀態(tài)為對細胞治療“應(yīng)答”；移植6個月后仍未脫離CLI狀態(tài)或在6個月內(nèi)行踝上截肢為對細胞治療“無應(yīng)答”。(2)篩選影響PBMNCs治療后無應(yīng)答者的可能危險因素。根據(jù)本課題組臨床經(jīng)驗，患者自身因素包括：年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、復(fù)吸煙、肢體壞疽或感染、動脈閉塞平面、踝肱指數(shù)(ABI)及經(jīng)皮氧分壓(Transcutaneous oxygen pressure, TcPO2)、炎癥反應(yīng)、血糖、高凝狀態(tài)、單個核細胞總移植數(shù)、CD34+細胞移植總數(shù)等[9-10]。(3)確立影響患者預(yù)后的獨立因素。由于以上危險因素之間可能有相互關(guān)系，如動脈閉塞平面和ABI、ABI和TcPO2等。因此需要去除混雜因素，進一步確立數(shù)個互相獨立的最重要的因素用以預(yù)測分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理使用單因素Logistic回歸分析法確立無應(yīng)答患者的因素。使用多因素Logistic回歸分析法篩選和確立無應(yīng)答患者的獨立因素。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1療效及預(yù)后30例NO-CLI患者行自體PBMNCs移植術(shù)治療效果良好，6例術(shù)后效果不佳最終行截肢手術(shù)。

2.2生存預(yù)后的影響因素分析(1)單因素回歸分析結(jié)果顯示：吸煙、復(fù)吸煙、性別、肢體壞疽或感染、動脈閉塞平面、踝肱指數(shù)(ABI)、TcPO2、炎癥反應(yīng)、血糖均與自體PBMNCs移植術(shù)治療NO-CLI的生存預(yù)后有關(guān)(P<0.05)。多因素回歸分析提示，TcPO2是影響自體PBMNCs移植術(shù)治療NO-CLI療效的獨立因素(P<0.05)。見表1。

3 討論

骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells, BMMNCs)和PBMNCs含有血管內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)，能通過直接分化或旁分泌血管新生因子的途徑促進微血管形成和成熟。早在2002年TateishiYuyama等[11]首次報道自體骨髓干細胞移植治療 CLI 以來，以治療性血管新生為目標的自體PBMNCs移植術(shù)治療CLI已成為干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方向的研究重點。國內(nèi)外I～II期臨床試驗證明了該法的安全性和可行性，并表明該法能降低CLI患者的截肢風(fēng)險，延長患者的無截肢生存率和提高其生活質(zhì)量[12-14]。相較BMMNCs，PBMNCs采集時操作簡單、微創(chuàng)，無需麻醉，尤其適用于全身情況較差的高齡患者。

表1 單因素和多因素回歸分析

表1單因素回歸分析中，P<0.05項為與自體PBMNCs移植術(shù)治療NO-CLI的療效生存預(yù)后相關(guān)的因素；多因素回歸分析中，P<0.05項為影響自體PBMNCs移植術(shù)治療NO-CLI療效的獨立因素

雖然自體PBMNCs治療CLI的前景良好，但仍有相當(dāng)一部分NO-CLI患者的療效較差甚至對治療無應(yīng)答。表現(xiàn)為術(shù)后短期內(nèi)即截肢、長時間肢體靜息痛不能緩解，以及傷口無法愈合。Madaric J等[15]報道經(jīng)自體BMMNCs治療12個月后無應(yīng)答患者的比例高達40%(22/55)。無應(yīng)答患者的獨立危險因素為低水平的CD34+細胞移植總數(shù)和TcPO2。Sun LJ等[16]報道了自體PBMNCs治療NO-CLI的5 a無截肢生存率為72.2%(20/83)，發(fā)現(xiàn)影響截肢的危險因素為纖維蛋白原>4 g/L和空腹血糖>6 mmol/L。近期Naoyoshi Aoyama 等[17]報道了經(jīng)自體PBMNCs移植術(shù)的NO-CLI患者術(shù)后3個月踝上截肢率為18.4%(7/38)，并發(fā)現(xiàn)截肢患者術(shù)前病變累及股動脈和腘動脈的比例顯著高于非截肢患者。

本研究通過篩選后36例NO-CLI患者經(jīng)過自體PBMNCs移植術(shù)治療后，30例患者術(shù)后效果良好，6例術(shù)后效果不佳最終行截肢手術(shù)。篩選與疾病相關(guān)的因素，并將2組患者進行比較。經(jīng)過單因素回歸分析篩選出有效的相關(guān)因素有吸煙、復(fù)吸煙、性別、肢體壞疽或感染、動脈閉塞平面、ABI、TcPO2、炎癥反應(yīng)及血糖。它們均與自體PBMNCs移植術(shù)治療CLI的療效及生存預(yù)后有關(guān)。再將這些篩選出的相關(guān)因素進一步進行多因素回歸分析，證實TcPO2是影響自體PBMNCs移植術(shù)治療NO-CLI療效的獨立因素。因此，可將TcPO2作為自體PBMNCs移植術(shù)治療NO-CLI術(shù)后療效的評判指標，為肢體重度缺血的患者是否行單個核細胞移植治療提供預(yù)測性分析，從而更合理地決定治療方案。

本課題受限于樣本量偏小，這會導(dǎo)致數(shù)據(jù)收集、分析過程中存在偏倚，其中最主要問題為： (1)本該篩選出影響預(yù)后的因素沒有篩選到。(2)預(yù)測精度評價與驗證可信度不高。尚需收集更多樣本量進一步研究，為結(jié)論提供更為客觀依據(jù)。