神經節苷脂GM3聯合姜黃素對血管平滑肌細胞行為的影響

★ 張清源 王龍 高萌 黃振東 吳千言 陳洪福 敖梅英（江西中醫藥大學 南昌 330004）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致冠心病和中風等心血管疾病的主要病理基礎，是危害人們身體健康的罪魁禍首之一，是許多重要常見疾病或死亡的根源［1］。血管平滑肌細胞是構成血管壁的主要成分之一，其異常增殖、遷移、泡沫化、膠原蛋白分泌等生理行為是動脈粥樣硬化發展過程的關鍵影響因素［2］。

姜黃素的母體之一有姜黃，是破血行氣，通經止痛的常用中藥。現代研究發現姜黃素可以抑制炎癥反應、抗氧化、抗類風濕、抗動脈粥樣硬化等作用［3］，臨床上已將其用于防治老年癡呆等疾病，但是如何提升其防治動脈粥樣硬化的效用有待進一步探索。神經節苷脂GM3是含單個唾液酸的神經節苷脂，在動脈粥樣硬化斑塊中GM3含量為正常血管內壁的多倍［4］，已有研究于2019年證實血液GM3微環境可多環節延緩動脈粥樣的形成與發展［5］。那么GM3微環境是否對姜黃素調整血管平滑肌細胞行為具有協同作用呢？本文將探討GM3、姜黃素兩者單用與聯合使用（即GM3微環境下使用姜黃素）對血管平滑肌細胞行為的影響，以期從血管平滑肌細胞角度為GM3與姜黃素預防或治療動脈粥樣硬化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞與培養基大鼠胸主動脈平滑肌細胞（RASMCs）購自湖南省長沙市湘雅醫學院細胞中心。高糖培養基（DMEM）購自美國Gibco生物試劑公司，胎牛血清購自美國Hyclone生物試劑公司，胰蛋白酶、青霉素與鏈霉素購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.2 藥物試劑及其配置神經節苷脂GM3粉末購自瑞士Adipogen生命科學試劑公司，以磷酸緩沖溶液（PBS）為配置液。姜黃素粉末購自北京索萊寶生物科技有限公司，以細胞培養基為配置液。氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL)購自廣州奕源生物科技有限公司，用PBS稀釋至實驗濃度。羥脯氨酸（Hyp）測定試劑盒（A030-1-1）購自南京建成生物試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組RASMCs以含8%胎牛血清與1%青霉素與鏈霉素的DMEM為培養基，在37 ℃，5% CO2的生化培養箱中培養。顯微鏡下觀察生長情況，細胞鋪滿基底時，用胰酶消化并傳代。進行各項指標檢測實驗時，將細胞分為對照組（常規培養基）、模型組（常規培養基添加誘導劑）、GM3給藥組（誘導劑+10 μg/mL或50 μg/mL GM3）、姜黃素給藥組（誘導劑+10 μM或20 μM姜黃素）、聯合用藥實驗組（誘導劑+10 μg/mL GM3+10 μM 姜黃素）。

1.2.3 細胞活性檢測RASMCs以約5 000細胞/孔的密度種于96孔板，細胞大致鋪滿孔板基底后，添加不同濃度GM3與姜黃素，分別作用于細胞18 h。之后采用MTT試驗法，棄培養基，PBS清洗細胞2遍，吸干，加培養基100 μL，加5 mg/mL的MTT 20 μL，混勻，37 ℃，5%CO2的細胞培養箱孵育4 h。之后棄液體，加100 μL DMSO，37 ℃避光輕輕震蕩10 min，使晶體完全溶解。酶標儀提前預熱30 min，570 nm 測定吸光值［6］。

1.2.3 細胞增殖檢測同上述操作種孔，待細胞貼壁3h左右，血清饑餓處理8 h［6］。PBS清洗后，模型組與實驗組以10%FBS為刺激劑誘導細胞異常增殖，實驗組同時給予預設濃度藥物，分別繼續培養48 h。后續操作同上述MTT步驟。

1.2.4 劃痕試驗法［7］將對數生長期的RASMCs種于24孔板，給予上述MTT法相同的血清饑餓處理，待鋪滿基底的75%左右時，用100 μL槍頭在孔板中央劃一條寬度均勻的線，之后用PBS緩沖溶液洗去劃線所致的漂浮細胞，即刻無菌顯微成像，記作0 h。之后以10%FBS為刺激劑誘導細胞異常增殖遷移，培養箱繼續培養24 h，再次成像，記作24 h。將前后成像的劃痕圖片，通過Image J軟件進行細胞遷移定量分析。

1.2.5 油紅染色法以80 μg/mL的ox-LDL刺激模型組與實驗組細胞24 h，誘導RASMCs脂質沉淀與泡沫化。增加誘導劑的同時，實驗組增加不同濃度藥物干預細胞泡沫化過程。干預結束后以PBS清洗細胞，用4%多聚甲醛于室溫固定細胞20 min，PBS清洗，60%異丙醇預處理細胞2 min；之后用新配置的0.5%油紅O避光染色30 min,然后用60%異丙醇室溫避光脫色5~10 min 2次；PBS再次清洗2次，顯微鏡成像［8］。平均脂質沉淀面積與總細胞面積的比例情況，以Image J軟件進行定量分析。

1.2.6 消化檢測法［9］羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中占極少量，其它蛋白中均不存在，故采用消化法檢測羥脯氨酸水平，以反應細胞膠原蛋白分泌水平。以80 μg/mL的ox-LDL刺激細胞異常分泌膠原蛋白，誘導的同時，實驗組增加藥物干預，作用36 h候，取細胞培養液進行羥脯氨酸水平檢測，步驟參照試劑盒說明書。

1.3 統計學方法

實驗數據采用Prism Graphpad 5軟件進行統計學分析，各組數據均進行正態檢驗及方差齊性檢驗，采取方差分析。

2 研究結果

2.1 藥物對細胞活性的影響

為摸索藥物的適宜實驗濃度，設置多個濃度進行藥物毒性實驗，采用MTT法檢測剩余活細胞數目情況，以揭示不同濃度藥物對細胞活性的影響。結果顯示:當外源GM3濃度高達100 μg/mL時，吸光值略有下降，但無顯著性差異；10、20 μM的姜黃素濃度對細胞活性無影響；當姜黃素濃度高至40、80 μM 時，RASMCs活性受到抑制，與 0 μg/mL藥物濃度組相比，呈現顯著性差異。為避免藥物對細胞活性的影響，本研究GM3藥物濃度設置為10、50 μg/mL，姜黃素藥物濃度設置為 10、20 μM。見圖1。

圖1 不同藥物濃度對RASMCs細胞活性的影響

2.2 藥物對細胞增殖的影響

藥物對細胞異常增殖的影響，實驗顯示：10 μg/mL外源GM3對RASMCs增殖無明顯抑制作用；50 μg/mL外源GM3可抑制RASMCs增殖，與Model組相比呈顯著性；10 μM姜黃素對RASMCs增殖無明顯影響；20 μM姜黃素對RASMCs增殖呈抑制效果，與Model組相比呈顯著性；然而，當GM3與姜黃素協同作用于RASMCs時，即使濃度分別低至10 μg/mL與10 μM，對RASMCs增殖亦呈現抑制效果，與Model相比呈極顯著性，呈現協同增效的抑制作用。見圖2。

圖2 不同藥物濃度對RASMCs細胞增殖的影響

2.3 藥物對細胞異常遷移的影響

細胞劃痕試驗顯示，10 μg/mL外源GM3對RASMCs異常遷移無明顯抑制作用；50 μg/mL外源GM3對RASMCs異常遷移呈現抑制作用，與Model組相比呈顯著性；10 μM 或 20 μM 姜黃素對RASMCs異常遷移無明顯影響；當GM3與姜黃素協同作用于RASMCs時，即使濃度分別低至10 μg/mL與10 μM，對RASMCs異常遷移呈現抑制效果，與Model相比呈極顯著性，呈現協同增效的抑制作用。見圖3。

圖3 劃痕法檢測藥物對RASMCs異常遷移的影響

2.4 藥物對細胞泡沫化的影響

油紅O著色脂質沉淀試驗顯示，10 μg/mL外源GM3對RASMCs脂質沉淀有抑制趨勢，但無顯著性差異；10 μM姜黃素對RASMCs脂質沉淀亦無明顯影響；當兩者以相同濃度協同作用于RASMCs時，RASMCs脂質沉淀被抑制，呈現協同增效抑制作用，與Model組相比差異呈極顯著性。見圖4。

圖4 油紅O染色檢測藥物對RASMCs泡沫化的影響

2.5 藥物對細胞分泌膠原蛋白的影響

羥脯氨酸檢測實驗顯示，當外源GM3與姜黃素單用，濃度分別為 10 μg/mL、10 μM 時，對RASMCs膠原蛋白分泌量無明顯影響；當兩者聯合作用于RASMCs時，細胞膠原蛋白分泌被抑制，呈現協同增效抑制作用。見圖5。

圖5 不同藥物對RASMCs膠原蛋白分泌量的影響

3 討論

血管壁由內膜、中膜、外膜三層組成。血管平滑肌細胞是構成血管壁中層的主要細胞成份,是血管執行生理功能的結構基礎，對血管壁的完整性和調節血管的緊張性起著重要作用，其增殖、遷移、泡沫化、膠原合成等生理行為異常是動脈粥樣硬化發展的關鍵步驟［10-12］，研究藥物對血管平滑肌細胞細胞的生理和病理行為的影響，對于深入了解藥物防治動脈粥樣硬化具有重要意義。

已有研究通過apoE-/-C57小鼠實驗證明外源性GM3顯著降低血脂水平和動脈粥樣硬化斑塊面積的作用，揭示了富含GM3的微環境在動脈粥樣硬化形成中起保護作用［5］。姜黃素是一種從姜科植物姜黃等的根莖中提取得到的黃色色素，為酸性多酚類物質，主鏈為不飽和脂族及芳香族基團，不溶于水。神經節苷脂GM3為帶唾液酸脂類小分子物質，在動脈粥樣硬化斑塊表面富含。外源添加GM3為血管RASMCs提供了富含GM3分子的微環境，該微環境抑或促進姜黃素物質的流轉，從而幫助調整血管平滑肌細胞異常生理行為。