黃芪甲苷對STZ誘導的1型糖尿病小鼠腎組織galectin-3/ERK1/2信號通路的影響

★ 宋高峰 翁文慈 王文靜 彭玲（.深圳市中醫院腎病科 廣東 深圳 58033；.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院 廣東 深圳 58033）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見且嚴重的微血管并發癥之一，是導致終末期腎病的主要原因，嚴重影響患者的生活質量［1］。DKD的發病機制甚為復雜，涉及血流動力學異常、線粒體功能失調、脂代謝紊亂、晚期糖基化終末產物（AGEs）形成增加、氧化應激等多種因素，目前尚缺乏特效的治療藥物。

半乳糖凝集素-3（galectin-3）是半乳糖結合素家族的的重要成員之一，主要由巨噬細胞分泌，其在細胞黏附、增殖、活化和凋亡等方面發揮著重要的調節作用，參與了炎癥及纖維化等病理過程，可能成為癌癥、免疫炎性及代謝性疾病治療的新型靶標［2］。研究表明，galectin-3與DKD關系密切。galectin-3與DKD患者尿蛋白及血肌酐存在顯著相關性，隨著病情的加重，galectin-3在血清中的表達逐漸升高，其表達量與尿蛋白呈正相關，與血肌酐呈負相關［3］。galectin-3可能參與了DKD的發生、發展，但其具體作用機制目前尚不明確。

黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）是黃芪藥理活性的主要成分之一，近年來AS-Ⅳ的腎臟保護作用越來越受到重視。AS-Ⅳ可通過抗氧化［4］、減輕炎癥反應［5］等多種作用機制發揮保護腎功能、減輕蛋白尿，治療DKD的作用。然而AS-Ⅳ對DKD的保護作用是否與調控galectin-3有關尚未見報道。本研究基于galectin-3/ERK1/2信號通路進一步研究AS-Ⅳ對小鼠DKD的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5～6 周齡雄性 C57BL /6J小鼠，體重為 16～18 g，購自廣東省醫學實驗動物中心。

1.2 主要藥物與試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma-Aldrich公司）；AS-Ⅳ（成都康邦生物科技有限公司）；galectin-3一抗（美國abcam公司）；p-ERK1/2一抗（美國Cell Signaling Technology公司）；尿白蛋白ELISA試劑盒（美國Bethyl公司）；β-actin抗體（美國Sigma-Aldrich公司）；二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 主要儀器

垂直電泳儀、轉膜儀、全自動凝膠成像和化學發光圖像分析系統（美國Bio-Rad Laboratories公司）；熒光顯微鏡及成像系統（日本NIKON公司）；血糖儀及試紙（瑞士Roche公司）。

1.4 造模與分組

C57BL/6J小鼠30只，適應性飼養1周后，采用隨機數字表法，取10只為正常組，其余20只為模型組。造模前禁食不禁水12 h，糖尿病模型組小鼠給予一次性腹腔注射STZ（溶解于0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.6，200 mg/kg），正常對照組注射相當體積的枸櫞酸鹽緩沖液，于72 h后小鼠尾靜脈取血測血糖，隨機血糖＞16.7 mmol/L，則確認模型成功。剔除血糖未達標的小鼠。取造模成功的小鼠，采用隨機數字表法，分為模型組（STZ組，n=6），AS-Ⅳ治療組（STZ+AS-Ⅳ組，n=6）。另外從正常小鼠選組6只作為對照組（Control組）。Control 組和STZ組給予標準飼料喂養，STZ + AS-Ⅳ組給予添加AS-Ⅳ的飼料喂養（按5 g∶1 kg比例將AS-Ⅳ和飼料混勻，塑形封裝后經鈷60照射），共計觀察8周。

1.5 標本采集及保存

在給藥8周后，于實驗動物處死前1 d將各組大鼠分別放置于代謝籠中，收集24 h尿液并記錄尿量，采集小鼠8周時血清及腎臟組織標本。步驟如下：水合氯醛麻醉后，摘除眼球快速留取血液標本1 mL，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，取血清裝入1.5 mL EP管中，-80 ℃凍存備用。取血結束后立即斷頸處死，沿腹正中線剖開腹腔，取出腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后左腎縱向切為兩半，取一半置于10%中性甲醛固定做病理檢查。另一半及右腎組織分離皮髓質后裝入1.5 mL EP管中，液氮快速冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于Western blotting檢測。

1.6 標本檢測

血肌酐及尿素氮由深圳市中醫院檢驗科檢測，尿白蛋白使用ELISA方法測定，各組小鼠禁食6 h后用羅氏血糖儀測定空腹血糖，各指標檢測均按照相應的試劑盒說明書進行操作。免疫組化染色鑒定galectin-3及p-ERK1/2在腎組織中的表達定位，Western blot方法檢測腎皮質組織中galectin-3、p-ERK1/2的蛋白含量。

1.7 腎組織病理學檢查

腎組織石蠟切片行PAS染色后，每組隨機選取3個樣本，使用熒光顯微鏡下測量30個腎小球血管襻面積，用成像系統拍照，將拍好的照片導入計算機中，用NIS-Elements圖像處理軟件（Nikon Corporation，Tokyo，Japan）進行圖片統計分析。

1.8 免疫組化檢測腎組織galectin-3及p-ERK1/2表達

（1）石蠟切片進行脫蠟；（2）抗原用檸檬酸緩沖液修復；（3）3%雙氧水（H2O2）滅活內源性過氧化物酶；（4）galectin-3（1∶100），p-ERK1/2（1∶200）4 ℃孵育過夜；（5）37 ℃復溫，PBS 洗滌，二抗（1∶1 000）37 ℃孵育 30 min；（6）PBS 洗滌，DAB顯色；（7）蘇木素復染，中性樹膠封片。

1.9 Western blot檢測腎組織galectin-3，p-ERK1/2蛋白的表達

（1）取冷凍保存的小鼠腎皮質組織，稱重，加入適量蛋白裂解液，冰上勻漿，在4 ℃下12 000 r/min條件下離心10 min后取上清液提取總蛋白，以BCA方法對上清進行蛋白定量；（2）制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳至溴酚藍跑出分離膠后，將蛋白轉移至PVDF膜上；（3）TBS 洗膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h；（4）根據目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜；（5）次日用TBS液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗室溫下孵育1 h；（6）TBS液洗4次，每次10 min，之后在Bio-Rad全能成像儀上觀察、分析條帶；（7）β-actin作為內參，以目的蛋白灰度值／內參灰度值反映蛋白的相對表達水平。

1.10 統計學方法

應用SPSS 17.0軟件分析系統進行統計學處理。計量資料用均數±標準差（±s）表示，當數據符合正態和方差齊時，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AS-Ⅳ對STZ誘導的1型糖尿病小鼠24 h尿白蛋白的影響

與Control組比較，STZ組小鼠24 h尿白蛋白明顯升高（P＜0.001）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組小鼠24 h尿白蛋白明顯下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠24 h尿白蛋白比較

2.2 AS-Ⅳ對STZ誘導的1型糖尿病小鼠血肌酐、血尿素氮及血糖的影響

與Control組比較，STZ組小鼠血肌酐升高，但差異無統計學意義；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組小鼠血肌酐明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Control組比較，STZ組小鼠血尿素氮明顯升高（P＜0.01）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組小鼠血尿素氮未見明顯下降。與Control組比較，STZ組小鼠血糖明顯升高（P＜0.001）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組小鼠血糖無明顯差異。見表1。

表1 各組小鼠血肌酐、血尿素氮及血糖比較（±s，n=6）

表1 各組小鼠血肌酐、血尿素氮及血糖比較（±s，n=6）

注：與Control組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與STZ組比較，#P＜0.05。

組別 血肌酐/（μmol·L-1）血尿素氮/（mmol·L-1）血糖/（mmol·L-1）Control組 12.67±1.37 12.80±1.04 7.25±0.93 STZ 組 15.50±4.09 17.03±2.91** 30.63±4.10***STZ+AS- Ⅳ組 11.17±2.23# 17.25±3.79 32.89±5.97

2.3 AS-Ⅳ對STZ誘導的1型糖尿病小鼠腎組織galectin-3/ERK1/2信號通路相關蛋白表達的影響

Western blot結果所示，與Control組比較，STZ組腎皮質組織中galectin-3蛋白表達明顯增加（P＜0.001）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組腎皮質組織中galectin-3蛋白表達被抑制（P＜0.001）。與Control組比較，STZ組腎皮質組織中p-ERK1/2蛋白表達明顯增加（P＜0.01）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組腎皮質組織中p-ERK1/2蛋白表達被抑制（P＜0.001）。見圖2。免疫組化染色結果顯示galectin-3主要表達于腎小球中，腎小管中未見表達。見圖3。p-ERK1/2主要表達在腎小球中，腎小管亦有少量表達。見圖4。

圖2 各組小鼠腎皮質中galectin-3與p-ERK1/2蛋白Western blot結果

圖3 各組小鼠腎皮質galectin-3免疫組化染色結果

圖4 各組小鼠腎皮質p-ERK1/2免疫組化染色結果

2.4 AS-Ⅳ對STZ誘導的1型糖尿病小鼠腎組織病理學形態的影響

對腎臟組織切片分別進行PAS染色可見Control組腎內結構清晰完整，形狀規則，腎小球系膜基質未見增生；STZ組中可見系膜基質增多，系膜擴張，與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組系膜基質沉積程度明顯減輕，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5-6。

圖5 各組小鼠腎組織切片PAS染色

圖6 各組小鼠腎小球系膜基質面積比較

3 討論

腎小球肥大是DKD早期的形態學特征表現，是引起腎臟結構不可逆改變的始動因素，是最終引起終末期腎病的初始病理表現。在這一變化中，腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）聚集起了重要的作用。作為AGEs的受體之一，galectin-3與糖尿病及其并發癥關系密切，galectin-3通過其介導的免疫炎癥反應及AGEs受體作用等多種生物學效應參與了DKD的發生、發展，可能成為該病治療的潛在新靶點。研究表明，galectin-3在2型DKD中的表達較正常人明顯增多，且與蛋白尿呈正相關，與腎功能呈負相關，galectin-3與2型DKD的進展呈獨立相關性［3］。與其他腎臟疾病比較，DKD患者腎組織內galectin-3的表達明顯升高［6］。Galectin-3在 DKD高糖培養的腎小球系膜細胞中表達顯著上調，高表達的galectin-3可促進系膜細胞的增殖［7］。與既往研究一致，本研究顯示1型糖尿病小鼠腎小球存在系膜細胞增殖及系膜基質增生，腎皮質組織中galectin-3蛋白含量顯著增加，這提示糖尿病系膜基質增生可能與galectin-3的高表達有關。

ERK1/2信號通路在DKD的發生、發展過程中發揮重要作用。ERK1/2信號通路的活化可導致DKD早期ECM增生［8］。高糖刺激下腎小球系膜細胞ERK1/2信號通路被激活，可促進ECM的合成并抑制其降解［9］。高糖環境下多種細胞因子均可激活ERK1/2信號通路，galectin-3可能是激活ERK1/2信號通路的重要細胞因子之一。既往研究表明: galectin-3的下調導致MEK/ERK信號通路活性降低，并抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲［10］。Galectin-3可通過激活MEK/ERK信號通路促進體外高糖培養的系膜細胞的增殖，沉默galectin-3后，MEK/ERK信號通路受到抑制［11］。本研究結果顯示1型糖尿病小鼠腎組織中ERK1/2信號通路存在顯著活化，galectin-3可能通過提高ERK1/2磷酸化水平，激活ERK1/2，從而調控DKD腎小球系膜細胞的增殖和細胞外基質的增生，進而影響DKD的發生、發展。

AS-IV是黃芪的主要活性成分之一，具有抗炎、免疫調節、抗氧化、清除氧自由基、降血糖及抗衰老等多種藥理作用［12］。越來越多的研究表明，AS-IV對DKD腎臟具有保護作用，其保護作用與抑制MEK1/2-ERK1/2-RSK2信號通路［13］、減輕炎癥反應［5］、抑制足細胞凋亡［14］、調節線粒體質量調控［15］等多種機制有關。在本研究中首次發現AS-Ⅳ對galectin-3、ERK1/2均有顯著抑制作用，這提示AS-Ⅳ對DKD腎臟的保護機制可能與抑制galectin-3/ ERK1/2信號通路有關。

綜上所述，AS-Ⅳ對STZ誘導的1型糖尿病小鼠腎臟有明顯的保護作用，可減少蛋白尿，減輕腎組織損傷，其作用機制可能與抑制galectin-3/ERK1/2信號通路，進而抑制腎小球系膜細胞的增殖和細胞外基質的增生有關。該研究為AS-IV防治DKD提供了新的證據及可能靶點。