基于網絡藥理-分子對接探討活血疏肝湯促進膝關節置換術后加速康復的機制※

楊瀾波 米豫飛 鄒春雨 王戰朝

20 世紀90 年代，Kehlet 率先提出術后加速康復（Enhanced Recovery After Surgery，ERAS）的概念[1]。加速康復是在循證醫學的基礎上，通過一系列優化圍手術期治療的措施來加快康復過程。它最早用于胃腸道手術，取得了令人滿意的效果，近年來逐漸推廣至其他學科[2]。膝關節置換術（Total Knee Arthroplasty，TKA）是終末期膝骨關節炎最有效的治療方法之一[3]。據報道，美國每年進行TKA 手術70 萬例，預計2030年將增加到348萬例[4]。在TKA中，ERAS的核心是減少手術應激反應，減輕圍手術期疼痛，降低深靜脈血栓等并發癥的發生率，加速功能恢復[5-6]。目前，TKA 術后抗血栓及鎮痛治療以藥物為主，但存在出血、抗血栓作用不足、心血管意外、肝腎功能損害、嗜睡、惡心嘔吐及長期成癮等潛在風險[7]。因此，開發安全有效的抗血栓鎮痛藥物是目前TKA 術后加速康復研究中亟待解決的問題。

活血疏肝湯是國家級非物質文化遺產平樂郭氏正骨法的經典名方，根據骨傷科疾病三期用藥理論辨證論治組方而成，具有行氣疏肝、活血止痛的作用。杜志謙[8]等通過動物實驗證實，活血疏肝湯具有良好的抗炎鎮痛作用。喬清奎[9]報道，臨床應用活血疏肝湯可顯著降低TKA術后疼痛，無明顯不良反應。張曉輝[10]報道，活血疏肝湯具有減少腰椎術后下肢深靜脈血栓發生的作用。同時，本研究相關的臨床試驗顯示，活血疏肝湯對TKA術后血栓及疼痛的有效率分別為85.94%及93.19%，但其抗血栓鎮痛的具體機制尚不清楚。

本研究利用網絡藥理學及分子對接技術，獲取了活血疏肝湯的有效成分，并預測了這些成分的有效靶點，在分子水平上挖掘活血疏肝湯在TKA術后抗血栓及鎮痛作用方面的潛在機制，為活血疏肝湯在TKA術后快速康復中的廣泛應用與新藥物的開發提供理論支持。

1 方法

1.1 活血疏肝湯有效成分篩選活血疏肝湯由當歸、紅花、桃仁、柴胡、大黃、黃芩、甘草以及枳殼共8味中藥組成。在中醫藥系統藥理學數據庫（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索各味中藥所含的有效成分，根據口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30% 和類藥性指數（Drug Like Index，DL）≥0.18 等參數對活血疏肝湯的有效成分進行篩選。

1.2 藥物-成分-靶點網絡的構建將篩選獲得的有效成分轉換為PubChem_CID，導入中醫藥分子機制生物信息分析數據庫（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism for Traditional Chinese Medicine，BATMAN，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php），將參數設定為Score cutoff＞20，P＜0.05，獲得活血疏肝湯的有效靶點。根據篩選獲得的有效成分及靶點，構建藥物-成分-靶點網絡。

1.3 藥物與疾病共有靶點的獲得從毒性與基因比較數據庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http://ctdbase.org/）中獲得有關術后血栓（Venous Thrombosis）及疼痛（Postoperative Pain）的所有靶點，根據相關分數（Inference Score）＞50 選取有效疾病靶點。從DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/home/）中獲得有關血栓（Thrombosis）及疼痛（Pain）的靶點，根據基因-疾病關聯分數（Score-gda）＞0.1 選取有效疾病靶點。將兩個數據庫獲得的疾病靶點合并，獲得TKA 術后血栓及疼痛相關的疾病有效靶點。取疾病靶點與藥物靶點的交集，獲得共有靶點。

1.4 共有靶點的分析與篩選將獲得的共有靶點輸入STRING 11.0 數據庫（https://string-db.org/），種屬參數設置為人（Homo sapiens），得出共有靶點的蛋白質間相互作用（Protein Protein Interaction,PPI），以Combined Score＞0.4 為篩選標準，將篩選后的信息導入Cytoscape 3.6.0 軟件繪制PPI網絡并進行網絡拓撲分析，根據度值（Degree）＞平均值篩選出關鍵共有靶點。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析Metascape 數據庫（http://metascape.org/）可用于GO功能和KEGG信號通路富集分析，并且具有時效性和準確性的優點。將關鍵共有靶點上傳至Metascape，種屬參數設置為人（Homo species），即可獲得富集分析結果。

1.6 核心成分與高頻靶點蛋白的分子對接在蛋白數據庫（The Protein Data Bank，PDB，http://www.rcsb.org/）中獲得度值最高的前5個靶點的PBD結構文件。從TCMSP 數據庫中獲得靶點最多的8 個有效成分的Mol 2格式文件（3D結構）。將獲得的文件導入在線分子對接網站SwissDock（http://www.swissdock.ch/docking），依次分別進行高頻靶點與核心成分的分子對接，分析活血疏肝湯中的有效成分與靶蛋白的親和力。

2 結果

2.1 活血疏肝湯有效成分篩選通過TCMSP 數據庫獲取活血疏肝湯中8味中藥的有效成分，剔除重復項后共獲得有效成分196 個，其中132 個具有化學結構。

2.2 藥物-成分-靶點網絡的構建將獲得的有效成分導入BATMAN數據庫，獲得693個有效靶點。依據活血疏肝湯的有效成分及靶點，構建藥物-成分-靶點網絡。見圖1。

2.3 藥物與疾病共有靶點的獲得自CTD數據庫中獲得175個血栓靶點及38個疼痛靶點。自DisGeNET數據庫獲得36 個血栓靶點及209 個疼痛靶點。將靶點合并，獲得TKA 術后血栓及疼痛靶點共計389 個。取藥物靶點與疾病靶點的交集，獲得79 個活血疏肝湯與TKA術后血栓及疼痛的共有靶點。

2.4 共有靶點的分析與篩選通過STRING 數據庫對79個共有靶點進行PPI分析，將結果導入Cytoscape軟件繪制PPI網絡圖，見圖2。結果顯示，79個靶點之間存在644 種相互作用，靶點的最高度值為50，平均度值為16.51。根據大于平均度值篩選出35個關鍵靶點，為IL6、AKT1、TNF、PTGS2、IL1B、EDN1、CRP、IL10、F2、FGF2、IL4、SERPINE1、ESR1、PPARG、TGFB1、CNR1、CAT、NR3C1、CTNNB1、VCAM1、OXT、IFNG、OPRK1、DRD2、AVP、ENSG00000196689、CYP3A4、HTR1A、SLC6A4、C3、BDKRB2、FASLG、NFKB1、HTR3A以及ABCB1。

2.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析GO 功能富集分析結果主要分為生物過程（Biological Progress）、分子功能（Molecular Function）、細胞組成（Cellular Component）三個方面，主要涉及定位的維持（maintenance of location）、受體配體活性對細菌的反應（Receptor ligand activity response to bacterium）、細胞因子產生的調控（Regulation of cytokine production）、細胞對有機循環化合物的反應（Cellular response to organic cyclic compound）以及血液循環（Blood circulation）等，見圖3。KEGG通路富集分析顯示，涉及的主要通路依次為“hsa 05142:Chagas disease（American trypanosomiasis）”“hsa 05200:Pathways in cancer”“hsa 05140:Leishmaniasis”“hsa 04080:Neuroactive ligandreceptor interaction”“hsa 05205:Proteoglycans in cancer”以及“hsa 04066:HIF-1 signaling pathway”等，見圖4。

圖3 GO功能富集分析

圖4 KEGG通路富集分析

2.6 核心成分與高頻靶點的分子對接將PDB數據庫中獲得度值最高的前5 個靶點（IL6、AKT1、TNF、PTGS2、IL1B）與TCMSP 數據庫中獲得靶點最多的8個有效成分（beta-sitosterol、CLR、Supraene、betacarotene、Phytoene、icos-5-enoic acid、gadelaidic acid、7,8-dimethyl-1H-pyrimido[5，6-g]quinoxaline-2,4-dione），依次分別通過SwissDock 獲取其結合能，見圖5。其中Phytoene、beta-carotene 與PTGS2 的結合能最小（＜-10 kJ/mol），其分子對接結果顯示，有效成分與靶蛋白充分嵌合，具有較好的結合作用，見圖6。

圖5 高頻靶點與核心成分對接結合能（kJ/mol）

圖6 PTGS2分別與Phytoene（圖a）和beta-carotene（圖b）的分子對接結果

3 討論

網絡藥理學是研究藥物作用機制的有效途徑，通過網絡公共數據庫或早期研究獲得的數據來解釋功能藥物的作用機制。網絡藥理學研究策略符合中醫對疾病完整性的認識[11-12]。分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物設計的方法，主要研究分子間（如配體和受體）相互作用，并預測其結合模式和親和力的一種理論模擬方法。活血疏肝湯作為中藥復方，含有多種具有復雜化學結構的有效成分，通過不同作用靶點與多種作用途徑，共同發揮其獨特的臨床功效。而正是由于活血疏肝湯作用機制的多面性，傳統的藥理學評價方法難以確定其具體作用。本研究通過網絡藥理學及分子對接技術揭示了活血疏肝湯對TKA 術后血栓及疼痛的治療作用及可能的分子機制，為活血疏肝湯在TKA加速康復中的應用和有關機制的進一步研究提供參考依據。

3.1 活血疏肝湯有效成分抗血栓及鎮痛的藥理作用分析活血疏肝湯中含有的多種中藥與抗血栓及鎮痛作用密切相關。黃芩是一味被廣泛應用的中藥，具有抗炎鎮痛等諸多生物學作用，對多種疼痛有治療效果[13-14]。當歸不僅具有抗炎鎮痛作用，還具有抗血栓形成、抗血小板聚集、改善血黏度以及抗凝等生物學活性[15-16]。紅花不但能抑制血小板聚集和預防血栓，甚至能溶解已形成的血栓，同時具有強烈持久的鎮痛作用[17]。桃仁能通過抑制血小板聚集、改善血流動力學和抗炎癥來實現抗血栓作用[18]。柴胡具有抗炎鎮痛解熱作用，以此實現術后鎮痛[19]。在網絡藥理學分析中獲得靶點最多的5 個有效成分分別為betasitosterol、CLR、Supraene、beta-carotene、Phytoene。Beta-sitosterol 是黃芩的主要有效成分，其通過干擾前列腺素代謝來拮抗炎癥實現鎮痛作用，并在動物實驗中表現出明確的抗血栓活性[20-21]。CLR在紅花中含量較高，作為四種肽類激素的同源受體，通過受體-配體相互作用影響血管內皮屏障完整性和血管生成，同時也與疼痛發生有關[22]。Supraene 是黃芩的主要成分，也是一種天然的生物相容性脂質體，本身并不具有鎮痛或抗凝作用，但可與鎮痛及抗凝相關藥物結合后實現藥物的緩釋，從而增強藥理作用[23]。Beta-carotene與Phytoene 同屬于類胡蘿卜素，是紅花的主要有效成分，可以降低罹患許多疾病的風險，如心血管疾病、白內障形成、年齡依賴性黃斑變性及癌癥[24-26]。

3.2 高頻靶點與抗血栓及鎮痛機制關聯分析在PPI 網絡中，度值最高的前5 個靶點被認為是活血疏肝湯治療TKA 術后血栓及疼痛的樞紐基因，可能在TKA 術后加速康復中發揮重要作用。其中最值得注意的是，IL6 是TKA 術后炎癥反應的重要指標及影響術后疼痛的重要炎癥介質[27-29]。AKT1 被認為是治療下肢深靜脈血栓的關鍵基因，同時作為PI3K/Akt通路的關鍵分子與疼痛密切相關[30-32]。TNF 具有免疫調節、促炎作用，與術后疼痛密切相關且在下肢深靜脈血栓形成中起關鍵作用[33]。PTGS2 又名COX-2，已證實可引起大鼠下肢深靜脈血栓形成，同時也是TKA術后疼痛的主要靶點[34-35]。IL1B 是一種抗炎細胞因子，不但能緩解膝關節炎所致疼痛，也影響了下肢深靜脈血栓的形成[29,36-38]。

3.3 活血疏肝湯抗血栓及鎮痛機制分析Go功能富集分析挖掘了活血疏肝湯在TKA 術后抗血栓及鎮痛等生物學過程中的作用機制，預測了活血疏肝湯作用于血栓形成及疼痛的靶點，提示其作用集中發生于細胞膜內外及細胞膜本身的脂閥，同時作用于內質網導致一系列的蛋白合成，并在此基礎上通過受體與配體的相互作用，調控細胞因子的產生，影響血液循環，從而干預血栓與疼痛的病理學過程。KEGG通路富集分析則提示，活血疏肝湯主要通過調控腫瘤信號傳導通路、神經活性受體-配體作用、腫瘤蛋白聚糖、缺氧誘導因子1 信號傳導通路來實現TKA 術后抗血栓及鎮痛的作用。

3.4 活血疏肝湯核心成分與TKA 術后血栓及疼痛高頻靶點的結合分子對接可以評估配體和蛋白質在熱力學上是否具有結合的能力，還能進一步預測活血疏肝湯的作用靶點。若結合能＜-5.0 kJ/mol，說明結合性好。結合能越小，結合的效果越好。活血疏肝湯的核心成分與TKA 術后血栓及疼痛高頻靶點的分子對接結果顯示各成分與靶點的結合能均＜-5.0 kJ/mol，說明所有核心成分與高頻靶點均能獲得良好結合。另外，PTGS2作為活血疏肝湯作用于TKA術后血栓及疼痛的典型受體，與Phytoene、Beta-carotene 及Supraene等核心成分的結合能均小于-10 kJ/mol，且分子結構嵌合緊密，說明活血疏肝湯的核心成分與疾病高頻靶點具有良好的結合活性，以此實現TKA術后抗血栓及鎮痛作用。

本研究以網絡藥理學及分子對接技術為基礎，系統分析了活血疏肝湯治療TKA 術后血栓及疼痛的可能機制。結果提示，活血疏肝湯中的主要有效成分在分子水平上通過多路徑發揮藥理作用，主要涉及腫瘤信號調控、抗缺氧、抗炎癥等多種機制。本研究中，活血疏肝湯表現出良好的抗血栓及鎮痛功能，提示活血疏肝湯具有成為治療TKA 術后血栓與疼痛候選藥物的潛力，也為其藥物作用機制的進一步研究提供了理論基礎。