高效液相色譜法測定綠茶中咖啡因的含量

曹志龍 楊建

摘要 目的：建立HPLC法快速測定綠茶中的咖啡因。方法：甲醇+水=75+25（v/v）; Waters 2696-C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）;流速1.0ml/min，柱溫40℃，檢測波長280 nm，進樣量10μL。結果：濃度與峰面積呈良好的線性關系（r=0.9997）， 水浴加熱提取1.5h最佳。結論：用該方法測定茶葉中的咖啡因，操作簡單、快速、準確，結果令人滿意。

關鍵詞：咖啡因; HPLC; 茶葉; 含量分析

中國是茶的故鄉，制茶、飲茶已有幾千年歷史，名品薈萃，主要品種有綠茶、紅茶、烏龍茶、花茶、白茶、黃茶。茶葉的營養價值和藥理作用是與它的化學成分分不開的。它的化學組成約有四百多種，其中對人體營養價值與藥理作用關系比較密切的是多酚類、生物堿和維生素[2 ]。茶葉中含一定量的咖啡因，咖啡因又稱咖啡堿， 化學名為1， 3， 7- 三甲基黃嘌呤， 溶于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶劑。它是一種中樞神經興奮劑。一些人體和動物實驗認為咖啡因是一種較弱的致突變和致畸物， 還可引起局部缺血性心臟病， 心律不齊[3]。我國食品添加劑使用衛生標準GB2760- 86 規定，咖啡因的含量是飲料和茶葉中的一個重要品質指標， 其含量測定一直受到分析工作者的關注。本實驗對已經提純的綠茶采用直接稀釋處理后，將待測液用高效液相色譜法進行含量測定[4]。

1、儀器與試藥

高效液相色譜儀：Waters 2696， UV檢測器：Waters 2487，配有自動進樣器、在線脫氣裝置。色譜工作站：Millennium32。綠茶為市售，咖啡因對照品（批號：200808，中國藥品生物制品檢定所）;甲醇（色譜純，美國天地公司）;實驗用水均為純凈水。

2、方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18 （4.6×150）mm，5μm，大連依利特生產，流動相：甲醇︰水=25︰75，測定波長280nm， 柱溫：40℃，流速：1ml/min。

2.2 系統適用性試驗 取供試品溶液 10μ L進樣， 記錄色譜圖， 咖啡因峰的保留時間為6.730min，各峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，其后的雜質峰分理論板數按咖啡因峰計算不低于 2000。供試品及對照品的色譜圖見圖 1。

2.3 溶液制備

對照品儲備液：精密稱取干燥至恒重的咖啡因對照品5mg于10ml量瓶中，加甲醇定容，制成1ml含咖啡因0.5mg/ml的對照品溶液。

供試品溶液：裝好索氏提取裝置，精密稱取干燥茶葉粉末5.0g，置于卷好的濾紙套筒中，放入索氏提取器，在圓底燒瓶中加入50ml95%乙醇，水?。?5℃）加熱，連續提取約1.5h，抽濾，二次水洗滌濾渣，濾液轉入50ml容量瓶中，用二次水定容至刻度。搖勻，即為樣品儲備溶液。取樣品儲備液1ml于50ml量瓶中，即得。

2.4方法學考察

2.4.1 線性范圍的考察

精密稱取咖啡因對照品，配置成濃度為0.5mg/ml的溶液，作為貯備液。分別量取貯備液0.2ml，0.8ml，1.2ml，1.6ml，2.0ml置于10ml容量瓶，稀釋至刻度，得到濃度為10μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml系列標準溶液。取上述系列濃度溶液經0.45μm的微孔濾膜過濾，進樣，得系列濃度對應峰面積和保留時間。以標準溶液的質量濃度（X ）為橫坐標， 色譜峰面積 （Y ）為縱坐標， 繪制標準曲線， 其線性方程：Y=26661X-62352，相關系數：R=0.9999，表明咖啡因在10-100μg范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗

吸取綠茶提取液樣品10μL注入液相色譜儀， 重復測定6 次， 峰面積RSD=0.7%。

2.4.3 穩定性試驗 吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，6，12，24h進樣，測定峰面積RSD=2.4%，表明至少24h內供試品溶液仍保持穩定。

2.4.4 加標回收率試驗

精密稱量取 9份已知含量的同批樣品約2ml ，分別加入延胡索乙素對照品溶液0.2，0.4，0.6 ml各 3份， 按供試品溶液”制備方法制備后， HPLC測定， 記錄峰面積，計算回收率，結果見表2。

3 樣品測定： 取樣品 3批，按照供試品溶液制備方法操作后， HPLC 測定， 結果分別是35.70μg/ ml，35.56μg/ ml，34.96μg/ ml。

4 討論

4.1流動相的選擇：本試驗采用 HPLC法測定延胡索乙素的含量，采用甲醇- 水（體積比為 25： 75）為流動相，咖啡因的保留時間為6.730min，且分離度和對稱性均良好。

4.2提取溶劑的選擇：本試驗采用75%乙醇、95%乙醇提取，結果表明95%乙醇提取的樣品咖啡因含量高。

4.3提取時間的考察： 本試驗采用1 h、1.5 h、3 h水浴加熱提取，結果表明水浴加熱提取1 h咖啡因含量低于1.5 h，而水浴加熱提取1.5h、3 h含量無差異，故選擇水浴加熱提取1.5h。

參考文獻：

[1 ]江明性.新編實用藥物學[M]. 2版.北京：科學出版社， 2005： 191 - 192 .

[2 ]馮雪松，劉雅茹，王大成，等.支持向量回歸 -紫外分光光度法用于測量小兒氨酚匹林咖啡因片含量的方法研究[ J ] .廣東藥學院學報， 2006，22 （1） ： 43 - 46 .

[3 ]汪必琴，鄭亞西.紫外分光光度法測定飲料、 巧克力和茶葉中咖啡因含量的研究[ J ] .四川師范大學學報：自然科學版， 2000， 23 （3） ： 309 - 311 .

[4 ]唐根源，吳紅京，吳棱，等.等度反相高效液相色譜法測定茶多酚中的兒茶素和咖啡因[J ].色譜， 2001， 19 （3） ： 233 - 235 .