金蘭柚資源的遺傳多樣性及其親緣關系分析

湯雨晴，閆承璞，楊惠棟，王雨亭，尹 峰，戴明輝，李樂寶，胡鐘東，朱方紅*

（1.江西省農業科學院 園藝研究所，江西 南昌 330200；2.安福縣農業農村產業發展服務中心，江西 吉安 343000）

柚［Citrus maxima （Burm） Merr.］為蕓香科柑橘屬喬木，在我國南方地區廣泛種植，其產業在地方經濟發展中占據重要地位。金蘭柚、金沙柚和桃溪蜜柚合稱為井岡蜜柚［1］。金蘭柚果肉脆嫩、味甜少酸、豐產性好，并且極耐儲存［2］，被譽為“井岡蜜柚”之王，在江西省安福縣廣泛種植。金蘭柚果實為卵圓形，果基部有短頸［3］，但在安福縣栽培的金蘭柚卻存在近圓形、長橢圓形、葫蘆形和扁圓形等果形，形態學差異很大。果農對其栽種的各種果形金蘭柚來源并不清楚，是否存在同名異物或近似品種的情況也不得而知。

分子標記是在DNA分子水平上進行檢測，不受生育階段、外界環境等因子的影響，能客觀、真實地反映品種間的差異。目前，分子標記技術已被廣泛應用于柚類種質資源分析與親緣關系鑒別。劉勇等［4］以33對SSR引物對110份柚資源和12份柚類近緣種進行遺傳多樣性分析，將金蘭柚歸類在沙田柚品系，且與金沙柚親緣關系較近。陳巍等［5］利用SRAP標記對13份浙南柚類地方資源和琯溪蜜柚及芽變進行遺傳多樣性分析和鑒定。李先信等［6］采用形態學標記與SRAP分子標記技術，對分布于湖南特定生態條件下的47份地方柚類種質資源的遺傳多樣性及親緣關系進行分析，發現形態學標記與SRAP分子標記都能很好地將柚類品種進行分類，但SRAP標記所揭示的柚類種質間的遺傳差異更準確。劉召亮等［7］針對江西省內不同來源的金沙柚種質及其近緣種質進行遺傳多樣性分析。目前，針對金蘭柚果實形態差異對其進行分子層面解析的研究還沒有。本試驗收集安福縣不同果形金蘭柚，進行葉片形態觀察和果實品質的測定，并開展分子標記鑒定，探究了不同果實形態下金蘭柚生理品質和分子水平差異性，以期為安福縣金蘭柚品種鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

14份金蘭柚材料采集自安福縣，桃溪蜜柚和金沙柚采集自江西省農業科學院園藝研究所橫崗基地（表1）。本試驗所有樣品采集后立即帶回實驗室，用雙蒸水洗凈后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

表1 所采集柚材料的來源信息

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片形態的觀察 選擇成熟的葉片采集回實驗室，觀察葉片的葉形、葉尖、葉基和翼葉形狀。

1.2.2 果實品質的測定 用電子天平稱量果實重量，游標卡尺測定果皮厚度和果實橫縱經，果形指數=果實縱徑（mm）/果實橫徑（mm），用手持數字折射儀測定可溶性固形物含量。所有數據均錄入到Excel 2003軟件，并對數據進行統計分析，借助SPSS 19.0軟件利用鄧肯氏新復極差法進行多重比較。

1.2.3 基因組DNA的提取 采用改良CTAB法提取樣品DNA［8］，用NanoDrop 2000分光光度計測量其DNA濃度并統一稀釋至50 ng/μg備用，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.2.4 InDel引物合成 根據金蘭柚重測序數據，比對到晚白柚（website：http：//citrus.hzau.edu.cn/orange/download/index.php）參考基因組，篩選出27對擴增條帶清晰，位點雜合的InDel（Insertion-deletion）引物，引物序列見表2。

1.2.5 PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳 PCR反應體系為15 μL：7 mL的Mix液，0.3 μL 10 mmol/L的正向引物，0.3 μL 10 mmol/L的反向引物，1.5 μL 100 ng/μL模板DNA和6 μL ddH2O。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，Tm 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反應進行35個循環；最后72 ℃再延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳采用1.5%~2.0%質量百分比的瓊脂糖凝膠，電壓120 V，電泳15~20 min。

2 結果與分析

2.1 表型性狀分析

2.1.1 葉片特征 安福縣14份柚材料葉片特征如圖1所示。14份柚材料葉片均有淺波狀起伏，葉形從橢圓形至卵圓形到披針形，葉尖漸尖或鈍形，葉基圓形或楔形，翼葉心形或狹長，總體而言，形態差異較大。雖然這14份樣品葉形有差異，但均為單出復葉。

圖1 安福縣14份柚材料的葉片特征

2.1.2 果實品質特征 14份柚材料果實形狀見圖2。大部分樣品果形為卵圓形（S6、S7、S9、S11），但也有部分樣品果形為葫蘆形（S2、S5）、近圓形（S3、S10、S14）等，果形差異很大。表2為14份柚樣品果實品質分析結果。從表2可以看出，這14份柚樣品在單果重、果實橫徑、果實縱徑、果皮厚度、可溶性固形物含量上均存在顯著差異。單果重為333.75~1020 g不等；果形指數最小的接近1，近似于圓形，最大的可達到1.22；果皮厚度最薄只有10 mm，但最厚的可達到15.99 mm。可溶性固形物含量在11.45~15.00之間，不同果園采摘的柚果實可溶性固形物含量差異較大，同一果園采摘的柚果實可溶性固形物含量差異也很大。

圖2 安福縣14份柚材料的果實特征

表2 27對InDel標記引物序列

2.2 16份柚材料遺傳多樣性分析

27對引物擴增結果見圖3。結果顯示，試驗所用27對引物共擴增出54個清晰可辨的位點，平均條帶數為2，InDel標記片段的分子量主要集中在250~500 bp。這27個標記中，22個標記表現出位點多態性，多態率達到81.48%。這22對標記能明顯區分金蘭柚、桃溪蜜柚和金沙柚，但安福縣采集的14份柚材料在所有標記擴增條帶中均無差異。

圖3 InDel引物在16份柚材料中的PCR擴增結果

3 討論

分子標記技術是以個體間核苷酸序列差異為基礎的標記，在植物遺傳多樣性的研究當中，目前已有SRAP［5-6］、SSR［4，7］、RAPD［9］、ISSR［10］等分子標記技術得到了成功的應用。InDel標記在柑橘種屬分類中已有應用［11］，但在柚類種質資源遺傳分析中尚未應用。劉勇等［12］發現江西的柚類資源主要由沙田柚品種群、果實梨形或卵形的金蘭柚及其后代等品種群、雜種柚品種群組成，遺傳多樣性非常豐富。

本研究采用InDel標記分析安福縣14份金蘭柚樣品，并以桃溪蜜柚、金沙柚為對照，結果顯示：14份金蘭柚材料幾乎無遺傳學上的差異，但與金沙柚、桃溪蜜柚存在顯著差異。從分子水平上看，這14份樣品應均為金蘭柚。樣品S9為安福縣第一批金蘭柚樹，當地人稱之為金蘭柚母樹，已栽培近40年，安福縣大規模發展金蘭柚時曾經作為優良母株提供接穗。S9果形為卵圓形，果基部有短頸，符合文獻上對金蘭柚的描述［3］，S10與S9采摘自同一果園，果形為近圓形，但分子標記未顯示出差異性，推測S10應為S9的芽變，但只是發生了點突變，使用分子標記很難將其區分，應開發更加精確的分子標記或者對其基因組測序以準確判斷堿基突變位點。

本研究選擇安福縣6個具有代表性果園進行樣品采集，共收集金蘭柚樣品14份。果實品質分析結果顯示，不同果園金蘭柚果實大小和單果重差異較大，但同一果園差異較小，這一性狀受果園栽培管理措施的影響較大，可能與栽培者管理水平有關［13］。可溶性固形物含量在不同果園間存在差異，在同一果園內，如安福縣橫龍鎮樂谷村鼎盛生態農業有限公司采摘的2個樣品S5、S6可溶性固形物含量差異較大，這可能與采摘樣品環境（山上、山下）或者管理水平不一致有關［14］。果形性狀為受多基因控制的數量性狀［15］，屬于較穩定的遺傳性狀，一般受環境等影響較小，本試驗證明金蘭柚在分子水平上無明顯差異，但形態學相關分析可將14份金蘭柚材料粗分為梨形和偏圓形2種果形，可能由于表觀因素影響，需要進一步研究。本研究采用形態學標記和分子標記對14份金蘭柚進行遺傳多樣性分析，探究了不同果實形態下金蘭柚品質和分子差異，得出卵圓形和近圓形果形均為金蘭柚，本研究為安福縣金蘭柚品種鑒定提供了一定參考。

表3 安福縣14份柚材料果實的品質分析