SPP1基因在肺腺癌中的表達及與預后的相關性研究

欒艷超 梁超 韓青松 劉佳坤 楊立偉 李志峰

肺腺癌作為肺癌最常見亞型，其發病率逐年上升，死亡率高[1]，因肺癌早期無特有的臨床表現，導致大多患者確診時已出現局部及遠處轉移，無法手術治療[2]。目前，隨著生物治療及免疫治療的快速發展和廣泛應用，打破了肺癌以微創外科手術、放、化療為主的傳統治療方式，進而使得肺癌患者的生存期逐漸延長[3]；而早期肺腺癌患者如及時手術治療，可極大降低術后復發率及死亡率[4]。為此，我們亟需尋求可靠的用于早期診斷以及治療的靶標分子。研究發現，在肝癌細胞、乳房癌、胃癌中均檢測到SPP1異常高表達與臨床分期及預后有關[5-6]。本研究將生物信息學與分子生物學相結合，探討SPP1在肺腺癌中的表達及其與臨床表現及預后的關系; 旨在臨床上為LUAD診治及預后提供新的參考。

資料與方法

一、標本來源

本研究選取138例肺腺癌患者癌組織和癌旁組織標本，所有患者均于2014年12月至2015年12月期間我院行肺腺癌手術切除。入組標準：男性54.3%(75/138)例，女性45.7%(63/138)例，年齡35歲至88歲之間，根據國際第八版肺癌TNM 分期標準，將患者分為Ⅰ+Ⅱ期83例，Ⅲ+Ⅳ期55例(T1/2期101例、T3/4期37例，N0 期68例，N1/2 期70例，M0 期133例、M1期5例)，病理分級Ⅰ/Ⅱ 級82例、Ⅲ級56例，患者術前均未給予放、化療及其他生物治療，截止隨訪2019年12月，并已獲我院倫理委員會批準(編號：2021071)。通過門診復查、電話回訪等方式隨訪，記錄病情、病史詢問、腫瘤標志物檢驗、胸部CT等檢查，術后復發及死亡時間。

二、材料

基因擴增儀Eppendorf，熒光定量PCR儀:Mx3000p，RT Fiest Strand cDNA Synthesis Kit(Servicebio，G3330-100)，2 X SYBR Green qPCR Master Mix(low Rox)，Servicebio，G3321-01;引物購自上海生工生物。SP試劑盒(上?？菩郎?; DAB試劑盒(河北博海生物);一抗:SPP1多克隆抗體(河北博海生物)，濃度1 ∶200;生物素化通用二抗工作液;蘇木素染料(上海恒遠生物);辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(蘇州宇恒生物)等。

三、利用UALCAN數據庫分析SPP1表達與臨床關系

通過UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)行 TCGA Gene Analysis，檢索SPP1，選擇肺腺癌，檢出結果中運用泛癌表達分析(pan-cancer view)[7]。通過基于TCGA(The Cancer Genome Atlas)所搭建的數據可視化平臺UALCAN，在UALCAN 數據庫中進行TCGA 及CPTAC(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium)數據集中檢索SPP1，于數據庫選項中選擇肺腺癌。分別對年齡、性別、TNM 分期、淋巴結轉移等臨床特征分組及預后情況進行分析。

四、運用GEPIA、KM Plotter數據庫研究SPP1表達與預后關系

利用GEPIA 數據庫(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)進行SPP1的表達與肺腺癌患者生存關系的分析。GEPIA數據庫是用于分析來自TCGA (The Cancer Genome Atlas)和GTEx (Genotype-Tissue Expression)項目的RNA測序表達數據[8]。通過分析KM Plotter數據庫中SPP1肺腺癌樣本表達，使用Survival選項，繪制樣本表達與生存時間關系的Kaplan-Meier曲線，包括總生存率(overall survival，OS)[9]。

五、RT-qPCR檢測SPP1表達

通過TRIzol法提取細胞總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度。按逆轉錄試劑盒說明書將RNA合成cDNA，采用PrimeScript RT Enzyme Mix I進行RT反應。反應條件:1個循環的95℃、5 min;40個循環的95℃、10s 和60℃、30s，以GAPDH為內參.通過2-ΔΔCt方法表達SPP1相對表達量。獲得SPP1基因擴增和溶解曲線(圖1)。

圖1 SPP1基因擴增曲線圖(左)和溶解曲線圖(右)

六、Western blotting檢測SPP1蛋白表達

加入蛋白裂解液分離總蛋白， BCA法定量蛋白;經變性后行SDS-PAGE電泳，250mA恒定電流，轉膜90min;PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，一抗(稀釋度為1 ∶1000)，4℃孵育過夜;經TBST漂洗10min，重復3次;浸入二抗工作液(稀釋度為1 ∶5000)，37 ℃孵育1 h，再次TBST漂洗;滴入ECL化學發光試劑，行ECL檢測并拍照; 采用Image J 分析條帶灰度值。

七、免疫組織化學

石蠟切片、脫蠟、水化、抗原修復、滲透、封閉等操作后，給予一抗(SPPI抗體1 ∶200)過夜，給予生物素化通用二抗工作液;，加入辣根酶標記鏈酶卵白素工作液DAB染色，蘇木素復染，脫水封片。鏡下拍攝， Image-J軟件分析，棕色、褐色、黃色顆粒為(+)，無染色為(-)，隨機選取5個視野，計算平均吸光度。

八、統計分析

采用SPSS 23進行統計分析，以Graphpad Prism9.0作圖，運用Image J分析免疫組織化學染色結果。采用Kaplan-Meier和Cox回歸進行生存分析，采用t檢驗進行兩組定量資料的比較，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、SPP1在肺腺癌組織中高表達

我們前期利用UALCAN數據庫全面分析SPP1在人類常見惡性腫瘤中的表達，分析發現包括肺腺癌在內的多種惡性腫瘤組織中SPP1 mRNA表達明顯高于癌旁組織，并且可能發揮致癌基因的作用(圖2)。通過挖掘GEPIA數據庫和TCGA數據庫同樣驗證SPP1在肺腺癌組織中表達顯著高于肺正常組織(圖3，P<0.001)。

圖2 不同腫瘤組織中SPP1的表達水平

圖3 SPP1在肺腺癌與正常組織表達差異 A: GEPIA; B: UALCAN

二、GEPIA數據庫分析LUAD中SPP1 mRNA表達與預后關系

為了深入分析SPP1表達與LUAD患者預后關系，我們首先通過GEPIA數據庫分析SPP1 mRNA表達與LUAD患者預后的關系，發現 SPP1 mRNA高表達與更差的OS(P=0.016，圖4A)顯著相關，初步提示SPP1 mRNA高表達與預后不良有關。鑒于GEPIA中LUAD患者病例數有限，我們利用Kaplan -Meier Plotter數據庫對SPP1 mRNA表達與預后關系的進行了驗證，同樣發現SPP1 mRNA高表達的LUAD患者，其OS明顯縮短(P=5.2e-06，圖4B)，進一步證實SPP1 mRNA高表達與不良預后密切相關。

圖4 GEPIA和K-M數據庫檢測SPP1的表達對患者生存率的影響 A: GEPIA; B: K-M

三、UALCAN數據庫分析LUAD中SPP1表達與臨床特征關系

接下來，利用UALCAN數據庫分析了LUAD (515例)中SPP1的表達與臨床特征的關系，發現SPP1 mRNA的表達與LUAD患者的N分期(P<0.001，圖5D)顯著相關，且隨著N分期的增高SPP1的表達水平有著上升的趨勢，與TNM分期、年齡、性別無顯著相關性。利用CPTAC數據庫進一步分析SPP1蛋白表達與臨床特征的關系，結果顯示，SPP1蛋白表達在肺腺癌中顯著升高，且與LUAD患者的TNM分期(P<0.001，圖6B)、N分期(P<0.001，圖6D)顯著相關，且隨著TNM分期、N分期的增高 SPP1的表達水平有著上升的趨勢，但與年齡、性別無顯著相關性。

圖5 UALCAN數據庫中SPP1 mRNA 與臨床特征關系 (1)P<0.001

圖6 CPTAC 數據庫中SPP1 蛋白表達與臨床特征關系 (1)P<0.001

四、肺腺癌組織中SPP1高表達

我們為了進一步驗證肺腺癌組織中SPP1的表達情況，采用(RT-qPCR)檢測肺腺癌組織和對應癌旁組織，結果顯示，癌組織中SPP1 mRNA表達水平顯著高于對應癌旁組織，(n=39，P<0.001，圖7A)。然后采用western blot檢測10例肺腺癌組織和對應癌旁組織，結果顯示，肺腺癌組織中SPP1蛋白表達顯著上調(P<0.0149，圖7B、C)。運用免疫組化檢測138例肺腺癌石蠟切片中SPP1蛋白表達情況，結果顯示，SPP1蛋白在LUAD組織中表達顯著上調(P<0.001，圖8A)，SPP1定位于胞漿或核，(圖8C)。為了排除不同患者之間個體差異的影響，進一步分析69例配對肺腺癌組織與正常肺組織的免疫組化結果，同樣顯示肺腺癌組織中SPP1蛋白顯著高表達(P<0.001，圖8B)。

圖7 肺腺癌和正常肺組織中SPP1表達

圖8 免疫組化檢測SPP1蛋白在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達

五、肺腺癌組織中SPP1表達與臨床數據的相關分析

我們又對SPP1蛋白表達與肺腺癌患者臨床數據進行分析，以免疫組化評分中位數分為SPP1高表達組(n=69)和低表達組(n=69)，結果顯示在T3/4組(P=0.003)、淋巴結轉移組(P=0.041)、Ⅲ/Ⅳ期(P=0.023)與死亡(P=0.003)組患者的腫瘤組織中SPP1蛋白表達顯著上調(表1)。SPP1蛋白表達與腫瘤遠處轉移未見明顯統計學意義，考慮入組數較少(n=5)有關。

表1 肺腺癌中SPP1蛋白表達和臨床病理參數關系

六、肺腺癌組織中SPP1表達與患者預后

最后我們通過免疫組化結果，分析SPP1蛋白表達對患者總體生存時間(OS)的影響，統計分析發現，高表達組中位生存時30個月，而低表達組中位生存時間52個月。K-M生存曲線表明，肺腺癌患者中SPP1高表達組OS顯著降低(P=0.0017，圖9)。為了進一步分析SPP1蛋白高表達與患者預后影響因素，我們通過單因素Cox分析顯示LUAD患者預后的影響因素為SPP1蛋白表達(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)和M分期(P<0.001)。多因素Cox分析顯示LUAD患者預后獨立影響因素為SPP1蛋白表達(P<0.001)、TNM分期(P=0.034)和M分期(P=0.001)(表2)。

圖9 SPP1蛋白高表達與肺腺癌不良預后相關

表2 138例的肺腺癌患者總體生存期單因素與多因素Cox 回歸分析

討 論

肺腺癌因其局部侵襲、遠處轉移及耐藥等諸多原因，導致肺癌的治療效果仍不理想[10]。2019年美國有22.8萬人被診斷為肺癌，而死亡人數約16萬人[11]，數據表明，肺癌具有發病率高、死亡率高、預后差的特性，因此，探明肺癌發生、侵襲及轉移的機制仍然是目前肺癌研究的重點及難點[12]。如今隨著生物信息學、分子生物學、免疫學等諸多技術突破，分子靶向治療、免疫抑制劑治療的手段已廣泛應用于臨床，但仍未明顯降低肺癌患者的死亡率[13]。

SPP1基因是一種分泌型磷酸化糖蛋白，在多種腫瘤中高表達[14]。它屬于小整合素結合配體N型糖蛋白(SIBLING)家族，其在淋巴細胞、內皮細胞、骨細胞及多種惡性腫瘤細胞中高表達[15]。并且分為兩個功能序列，分別為N端RGD序列以及C端非RGD序列。在腫瘤組織中，細胞外基質被各種通路分泌的uPA、MMP等影響，進而對腫瘤的侵襲和遷移影響;C端非RGD結合CD44，促進信號通路激活[16]，進而可以導致免疫逃逸[17]。近年越來越多研究報道，SPP1參與多種惡性腫瘤的發生過程，如肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌、乳腺癌的生長，侵襲和轉移[18]。SPP1促進肝癌細胞增長并與肺腺癌的不良預后有關，且SPP1可促進肝癌的增殖和侵襲[19]。研究發現宮頸癌細胞和組織中SPPI表達上調，下調SPPI抑制HeLa細胞的生長，并可誘導宮頸癌細胞凋亡[20]。

但SPPI在肺腺癌的相關研究未見報道，我們前期利用UALCAN數據庫全面分析SPP1在人類常見惡性腫瘤中的表達，分析顯示多種惡性腫瘤組織中SPP1 mRNA表達顯著高于癌旁組織，進一步挖掘GEPIA數據庫和TCGA數據庫同樣驗證在肺腺癌組織中SPP1表達顯著高于肺正常組織。為了深入了解SPP1的表達與患者預后之間的關系，我們通過GEPIA數據庫挖掘SPP1 mRNA表達與肺腺癌患者預后關系，發現SPP1 mRNA高表達與更差的OS顯著相關，鑒于GEPIA中LUAD患者病例數有限，我們又對Kaplan-Meier Plotter數據庫中SPP1 mRNA表達與預后關系的進行驗證，得到相似結果，從而進一步證實SPP1 mRNA高表達與肺腺癌患者不良預后密切相關。

為了驗證數據庫分析結果，我們從分子水平分析SPP1的表達情況，采用qPCR、western blot 和免疫組化方法檢測SPP1的表達水平。結果表明，在mRNA轉錄水平和蛋白表達水平，均顯示肺腺癌中SPP1表達上調。以上分析表明在肺腺癌中SPP1可能起到致癌作用。又對臨床資料分析可見， SPP1表達與臨床分期、腫瘤大小、淋巴結轉移和生存狀況顯著相關。因多數發生腫瘤遠處轉移患者已無法通過手術治療，導致遠處轉移病例數偏少，可能導致研究結果與實際產生偏倚。本研究收集138例肺腺癌組織標本進行免疫組化檢測，進而從蛋白水平探討SPP1在LUAD中的表達與預后的關系，發現SPP1蛋白高表達與LUAD患者的OS縮短密切相關，此結果與GEPIA數據庫分析結果一致。Cox單因素和多因素回歸分析表明， SPP1蛋白表達、臨床分期和遠處轉移是影響患者預后的獨立危險因素。

以上實驗結果提示， SPP1在肺腺癌組織中呈高表達并可在一定程度上預測肺腺癌患者的不良預后。以上結果為肺腺癌患者在早期診治、臨床預后等多領域提供重要參考。但本研究僅從分子、蛋白水平對肺腺癌患者SPP1表達與預后分析，因而SPP1的表達與腫瘤的分子機制的研究將作為我們的后續研究方向。