LncRNADANCR表達與非小細胞肺癌的臨床病理特征以及預后的關系研究

張晨曦 佟雪梅

肺癌是全球高發的惡性腫瘤，我國肺癌發病率和病死率均位列惡性腫瘤之首，5年生存率僅為19.7%[1-2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)作為肺癌最常見和最具侵襲性的類型倍受醫學界關注，盡管開展了大量的研究，其潛在的分子機制仍未明確。現有研究發現長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid，lncRNA)表達和功能異常與NSCLC的發生密切相關[3]。分化拮抗非蛋白編碼RNA(differentiation antagonizes non-protein coding Rnas，DANCR)是一種有價值的腫瘤相關lncRNA，在肝細胞癌，乳腺癌，神經膠質瘤等多種惡性腫瘤中表達異常，與癌細胞增殖，遷移和侵襲有關[4]。但LncRNADANCR在NSCLC的表達特點以及臨床意義尚不清楚，本研究擬探討LncRNADANCR與NSCLC臨床病理信息和預后的關系。

資料與方法

一、臨床資料

本研究已經獲得院倫理委員會批準(批準號：150361)，回顧性選擇2015年12到2017年12月某院收治的173例NSCLC患者，納入標準：①均接受胸腔鏡肺癌根治手術，術后組織病理學證實病理類型為NSCLC；②術前未接受放療、化療、免疫、靶向以及中醫藥等形式抗腫瘤治療；③具備可供本研究分析的臨床和病理資料。排除標準：①同時經臨床確診合并其它部位原發惡性腫瘤或其它原發腫瘤發生肺轉移者；②經臨床確診的血液和免疫系統疾病；③組織標本損壞，無法完成檢測者。患者資料：男103例，女70例，年齡≥60歲105例，<60歲68例，腫瘤直徑≥3 cm 118例，<3 cm 55例；病理類型：鱗癌72例，腺癌53例，大細胞癌48例；分化程度：低～中度分化133例，高度分化40例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期82例，ⅢA期91例。

二、LncRNADANCR表達檢測

取病理室液氮冷凍保存的NSCLC的癌組織標本以及癌旁經病理證實為正常肺組織的標本，Trizol RNA 提取試劑(美國賽默飛公司)提取組織總RNA并進行純化，選取吸光度260/280比值位于1.9～2.1的 RNA，Invitrogen SuperScript反轉錄酶(美國賽默飛公司將RNA逆轉錄為cDNA，VeritiPro PCR儀(美國賽默飛公司)進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)，2-ΔΔCt計算LncRNADANCR相對表達量，取3次測量平均值。引物合成及序列測定由上海基康公司完成，序列：LncRNADANCR，上游，5′-GCCACAGGAGCTAGAGCAGT-3′，下游，5′-GCAGAG TATTCAGGGTAAGGGT-3′，β-actin(內參)，上游：5′-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3′，下游：5′-AAGGAA GGCTGGAAGAGT-3′。

三、隨訪

患者出院后由腫瘤科醫師或護理人員采用電話或微信形式隨訪3年，并定期接受門診復查，復查內容包括血常規和生化，腫瘤標志物以及肺CT/MRI，全身骨掃描等，結合實驗室和影像檢查結果，以再次發現肺部腫瘤病灶或遠處轉移病灶判定為腫瘤復發轉移。統計復發轉移以及全因死亡情況。無進展生存(progression-free survival，PFS)定義為自術后至腫瘤復發轉移、全因死亡或隨訪截止時間，總生存(overall survival，OS)時間，定義為自術后至全因死亡或隨訪截止時間。

四、統計學分析

結 果

一、NSCLC癌組織及癌旁組織LncRNADANCR表達比較

NSCLC癌組織與癌旁組織LncRNADANCR相對表達量分別為3.02±0.82、1.15±0.26，配對t檢驗結果示NSCLC癌組織LncRNADANCR相對表達量明顯高于癌旁組織(t=-27.684，P<0.05)(見圖1)。

圖1 NSCLC癌組織及癌旁組織LncRNADANCR表達

二、NSCLC癌組織LncRNADANCR表達與患者臨床病理特征的關系

腫瘤直徑≥3 cm 、TNM分期ⅢA期、低～中度分化患者LncRNADANCR表達高于腫瘤直徑<3 cm 、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高度分化患者(P<0.05)，不同性別、年齡分布、病理類型之間LncRNADANCR比較無統計學差異(P>0.05)(見表1)。

表1 不同NSCLC癌臨床病理特征患者LncRNADANCR表達比較

三、不同LncRNADANCR表達下NSCLC患者生存比較

173例患者中失訪21例，余152例患者在隨訪期間死亡84例，復發10例，遠處轉移17例，繪制Kaplan-Meier生存曲線分析，LncRNADANCR高表達(LncRNADANCR≥3.02，42例)3年PFS生存率為34.18%(27/79，95%CI：0.2465～0.4518)，3年OS生存率為18.99%(15/79，95%CI：0.1174～0.2911)，低于LncRNADANCR低表達(LncRNADANCR<3.02，40例)的56.16%(41/73，95%CI：0.4475～0.6696)、35.62%(26/73，95%CI：0.2558～0.4709)(Log-Rank χ2=8.862、7.287，P=0.003、0.007)(見圖2)。

圖2 不同LncRNADANCR表達下NSCLC患者3年生存曲線

四、影響NSCLC患者預后的單因素Cox比例風險回歸

以NSCLC患者生存情況為因變量(0=存活，1=死亡)，納入年齡(賦值：0=<60歲，1=≥60歲)、腫瘤直徑(賦值：0=<3 cm，1=≥3 cm)、病理類型(賦值：0=鱗癌，1=腺癌，大細胞癌)、分化程度(賦值：0=高度分化，1=低～中度分化)、TNM分期(賦值：0=Ⅰ～Ⅱ期，2=ⅢA期)、LncRNADANCR(賦值：0=LncRNADANCR低表達，1=LncRNADANCR高表達)為自變量。單因素Cox比例風險回歸分析結果顯示分化程度、TNM分期、LncRNADANCR高表達與NSCLC患者預后有關(P<0.05)(見表2)。多因素Cox比例風險回歸模型(向后逐步法篩選變量，入α=0.05，出α=0.10)，結果顯示TNM分期ⅢA期、LncRNADANCR高表達是NSCLC患者不良預后的危險因素(P<0.001)(見表3)。

表2 影響NSCLC患者預后的單因素Cox比例風險回歸模型

表3 影響NSCLC患者預后的多因素Cox比例風險回歸模型

討 論

隨著基因測序、基因芯片、PCR檢測等分子生物學技術的飛速發展，肺癌發病機制研究取得了一定的突破和進展。LncRNA是人類和哺乳動物多數基因組產物的存在形式，并調節絕大多數生理和病理過程，LncRNA作為增強劑、支架或誘餌通過與其他RNA或蛋白質相互作用，影響細胞信號級聯，蛋白質或核酸的功能和穩定性[5]。LncRNA表達異常，影響蛋白或核酸功能以及穩定性，包括惡性腫瘤在內的多種疾病發生和發展過程[6]。現有研究顯示，多種LncRNA參與NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲過程[7-8]，與NSCLC對化療的敏感性[9-10]有關。

LncRNADANCR是一種具有致癌作用的LncRNA，定位于人類染色體4q12，具有直接調控癌基因作用，還可通過扮演競爭性內源RNA間接調控miRNA 對靶基因的調節作用[11]。現有研究發現LncRNADANCR在卵巢癌中表達，通過靶向miR-145調控血管內皮生長因子表達，促使腫瘤新生血管形成[12]，在三陰性乳腺癌中，LncRNADANCR通過激活核受體視黃酸X受體α增強其絲氨酸磷酸化，啟動磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號轉錄，導致腫瘤發生[13]。LncRNADANCR高表達與骨肉瘤組織分型、TNM分期呈正相關，LncRNADANCR通過靶向miR-149/ Musashi 2(無中文名稱)軸調節骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[14]。本研究發現LncRNADANCR在NSCLC中呈高表達，且腫瘤直徑≥3 cm 、TNM分期ⅢA期、低～中度分化患者LncRNADANCR表達高于腫瘤直徑<3 cm 、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高度分化患者，說明LncRNADANCR高表達與NSCLC腫瘤直徑、分化程度以及TNM分期有關。Chen等人[15]報道顯示肺癌中LncRNADANCR表達上調，抑制LncRNADANCR表達則癌細胞增殖力減弱，凋亡增加，說明LncRNADANCR在NSCLC發病機制中可能發揮促癌基因作用。LncRNADANCR可能通過調節多種信號轉導途徑參與NSCLC發病和進展， LncRNADANCR可靶向miR-214-5p，啟動其下游基因鋅指蛋白1，調控肺癌細胞增殖和凋亡[15]。LncRNADANCR也可通過與高遷移率族盒蛋白4競爭性結合miR-138影響Sox4的表達參與NSCLC發病進展[16]。LncRNADANCR還可作用于Wnt/β-鏈蛋白信號通路[17]、miR-1225-3p/ erb-b2受體酪氨酸激酶2信號通路[18]、叉頭框蛋白O1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路[19]促進NSCLC細胞增殖、侵襲和轉移。也有學者認為LncRNADANCR可調節核因子κB 炎癥信號通路介導 NSCLC 腫瘤炎癥微環境，促使癌細胞增殖和遷移[20]。本研究進一步通過隨訪發現LncRNADANCR與NSCLC患者預后有關，LncRNADANCR高表達者PFS和OS生存率偏低，回歸分析證實LncRNADANCR高表達與術后腫瘤復發轉移和患者死亡有關，提示LncRNADANCR可作為NSCLC預后判斷的生物學指標。

綜上，NSCLC 癌組織中LncRNADANCR表達上調，LncRNADANCR高表達與NSCLC較大的腫瘤直徑、較高的TNM分期和低存活率有關。LncRNADANCR有望作為NSCLC預后判斷的潛在標志物，為NSCLC提供新的治療靶點和方向。LncRNADANCR與病理類型無關，與腫瘤分化程度、大小有關。