支氣管哮喘患兒血清骨膜蛋白、IL-13和miR-155水平相關性的研究

路黎娟，徐梅佳，董 焱，呂 偉，林 珍

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院兒科，上海 201999)

支氣管哮喘屬于多種炎性細胞參與介導的慢性呼吸道炎性疾病。以氣道高反應性、氣道慢性炎癥為主要特征，不同程度的氣促、喘息、咳嗽或胸悶為支氣管哮喘的主要臨床表現。支氣管哮喘的發病機制尚不明晰，但以往認為其發生與多種免疫細胞及產生的細胞因子有關聯。據流行病學調查顯示，受環境惡化及遺傳因素作用的影響，支氣管哮喘發病率呈逐年上升趨勢；同時其發病無特定年齡限制，且常于清晨及夜間發作[1-2]。近年來臨床研究發現，支氣管哮喘與免疫調節紊亂、炎癥反應、感染等因素密切關聯[3-4]。本文對127例支氣管哮喘患兒的骨膜蛋白(Periostin)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)和微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)水平進行檢測，并對其相關性進行研究。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年1月至2020年1月在上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院門診就診的支氣管哮喘患兒127例為研究對象(研究組)；選擇同時間段在本院接受健康體檢的兒童127例為健康志愿者(對照組)。

研究組：男66例，女61例；年齡為5～13歲；緩解期65例，急性期62例。對照組：男63例，女64例；年齡為3～15歲。兩組的性別、年齡、體質量指數(body mass index，BMI)、膳食鈣攝入量比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

納入標準：所有患兒均符合中華醫學會對支氣管哮喘的診斷標準[5]。排除標準：①一般資料不全；②患有先天性心臟疾病或肝腎等重要臟器功能不全；③患有血液系統、免疫系統疾病；④合并其他哮喘樣疾病或慢性肺疾病；⑤合并過敏性疾病。

本文研究內容均已告知患兒家屬并知情同意，同時獲得本院倫理委員會批準。

表1 兩組一般資料的比較Table 1 Comparison of baseline data between the two

1.2 肺功能的檢測

采用Master Screen肺功能儀對所有受檢兒童進行肺功能檢查。對每位受檢者測量3次以上，保留3次最佳數值，取其平均值。主要測試參數：第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 1 second，FEV1)，第1秒用力呼氣量占用力肺活量比值(ratio of forced expiratory volume in 1 second to forced vital capacity，FEV1/FVC%)，最大呼氣50%流量(maximal expiratory flow at 50%，MEF50)。

1.3 方法

對所有受檢兒童于接診當日采集外周空腹靜脈血5mL，要求血液標本無脂血和溶血，置于無抗凝劑試管中，室溫下凝固，3 000r/min離心處理15min，分離上清，-70℃低溫下保存待檢。

1.3.1 酶聯免疫吸附檢測相關指標表達水平

取50mL碳酸鹽緩沖液對抗原進行稀釋，加蓋處理，4℃冰箱內存放24h，第2天重復洗滌3次，拋干，將稀釋液(pH值為7.4的0.02mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標本0.1mL放入酶標本空白孔、標準孔、待測樣品孔內，同時放入陽性和陰性對照標本，42℃環境中存放1h，移除液體，3次洗滌后拋干，在每個孔中放Periostin、IL-13、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、γ-干擾素(interferon γ，IFN-γ)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白抗體0.1mL，存放1h，移除液體后進行3次洗滌并拋干，在每個孔中放入底物液(0.1mol/L的Na2HPO4，0.05mol/L的枸櫞酸)，混勻后放入0.1mL鄰苯二胺，進行20min遮光，再次將2mol/L的H2SO40.05mL放置在每個孔內，終止反應。在酶標儀下測定Periostin、IL-13、TGF-β1、IFN-γ、HIF-1α、VEGF具體數值，參照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 間接法檢測免疫功能T淋巴細胞亞群水平

將待測空腹靜脈血5mL/人傳代到5孔板中，置于37℃、5%二氧化碳的飽和濕度環境下培養1天、2天和3天，然后再加入0.25%胰蛋白酶進行消化，以2 000r/min離心5min收取細胞，收取細胞后使用PBS緩沖液洗滌3min，再重復洗滌2次，完成后以2 000r/min離心，收集細胞后加入1mL PI染液，一定要在避光的常溫下放置1h后，使用PE熒光染色進行特異熒光標記，在鞘液包裹下高速流動，流動期間會發射出光子，用流式細胞儀檢測T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.3.3 RT-PCR法檢測miR-155表達水平

提取TTK細胞總RNA，對提取總RNA的純度、含量進行檢測，隨后逆轉，逆轉錄處理后獲得cDNA，使用Primer 5.0軟件設計引物，采用2-△△Ct方法計算，內參U6。設置反轉錄反應條件：25℃ 10min，40℃ 1h，85℃ 5min；設置擴增條件：94℃ 20s，72℃ 30s，60℃ 30s，35個循環，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的miR-155表達量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兩組兒童肺功能指標情況

與對照組相比，研究組的FEV1、FEV1/FVC%、MEF50水平均顯著下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組兒童肺功能指標的比較Table 2 Comparison of pulmonary function indicators between the two

2.2 兩組兒童血清Periostin、IL-13和miR-155水平情況

與對照組相比，研究組的哮喘緩解期、哮喘急性期患兒的Periostin、IL-13、miR-155水平均顯著上升，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組兒童血清Periostin、IL-13和miR-155水平的比較Table 3 Comparison of serum Periostin,IL-13 and miR-155 levels among the

2.3 兩組兒童哮喘相關炎癥因子水平情況

在對照組、研究組的哮喘緩解期和哮喘急性期患兒中，TGF-β1、IFN-γ、HIF-1α、VEGF水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)；相比對照組，哮喘緩解期、哮喘急性期患兒TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均上升，IFN-γ水平下降(哮喘緩解期與對照組比較，t值分別為13.830、29.730、28.180、10.790，P<0.05；哮喘急性期與對照組比較，t值分別為39.140、26.420、29.540、19.170，P<0.05)；相比哮喘緩解期，哮喘急性期患兒TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均上升，IFN-γ水平下降(t值分別為14.270、15.970、13.510、11.160，P<0.05)，見表4。

表4 兩組兒童哮喘相關炎癥因子水平的比較Table 4 Comparison of the levels of inflammatory factors related to asthma among the

2.4 兩組兒童免疫功能情況

在對照組、研究組的哮喘緩解期和哮喘急性期患兒中，CD3+、CD4+、CD8+水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)；相比對照組，哮喘緩解期、哮喘急性期患兒CD3+、CD4+、CD8+水平均下降(哮喘緩解期與對照組比較，t值分別為12.400、21.480、9.374，P<0.05；哮喘急性期與對照組比較，t值分別為19.810、32.050、11.720，P<0.05)；與哮喘緩解期相比，哮喘急性期患兒CD3+、CD4+、CD8+水平均下降(t值分別為6.001、8.246、2.039，P<0.05)，見表5。

表5 兩組兒童免疫功能的比較Table 5 Comparison of immune functions among the

2.5 Periostin、IL-13和miR-155三者的相關性

采用Pearson進行相關性分析，Periostin與IL-13呈正相關(r=0.403，P=0.001)；Periostin與miR-155呈正相關(r=0.655，P=0.001)；IL-13與miR-155呈正相關(r=0.482，P=0.001)，見圖1。

3 討論

支氣管哮喘屬于慢性氣道炎癥疾病，以不同程度的咳嗽、氣喘、胸悶為主要癥狀。臨床研究表明，兒童機體器官及組織發育尚未成熟，肺泡較少、身體免疫力低下、呼吸道系統功能不全是導致其呼吸道細菌侵襲感染的主要原因[6]。近年來，隨著我國對支氣管哮喘研究的增多，發現其是由多種細胞和細胞組分參與的異質性疾病，多發于清晨或夜間；受環境、遺傳、氣候等多種因素影響，其發病率呈逐年上升趨勢[7]。若不及時接受有效治療，會引發呼吸衰竭，甚至死亡，對患者生命健康造成極大威脅。因此，準確有效地診斷對治療及預后評估具有重要意義。

3.1 Periostin、IL-13和miR-155生物學特征及其在支氣管哮喘發病中的作用

本研究顯示，急性期支氣管哮喘患兒Periostin、IL-13、miR-155水平均顯著高于健康兒童和緩解期患兒，提示Periostin、IL-13、miR-155均參與了哮喘的發生、發展過程。Periostin屬于細胞基質蛋白，于細胞表面與數種整合素分子相互作用，為組織生長、重構提供了條件[8]。相關研究顯示，在氣道上皮細胞中，Periostin蛋白通過促進纖維母細胞趨化因子生成，加劇患者肺部炎癥；同時，Periostin具有自分泌效應，通過調節相關細胞水平，在氣道纖維化過程中發揮作用，其是哮喘發病的作用機理[9]。IL-13主要由Th2細胞分泌，是重要的炎癥因子，具有多種效能。相關研究顯示，氣道的免疫調節和炎癥與IL-13有關聯，可單獨介導引起哮喘；同時，IL-13可對纖維細胞產生刺激，使其活化參與氣道重塑[10]。miRNA對臨床多種病理、生理的生物學改變具有調控作用，其表達水平能夠對多種疾病的發病情況做出相對反映。miR-155在T細胞分化過程中具有關鍵意義。在機體正常情況下，miR-155水平較為平穩，當機體發生疾病時，其水平呈異常高表達，因此，通過miR-155水平的檢測能夠對疾病嚴重程度做出直觀評估。本研究顯示，Periostin、IL-13、miR-155在支氣管哮喘中表達均較高，且其表達水平在急性期中均明顯高于緩解期。由此證實，Periostin、IL-13、miR-155與支氣管哮喘發生存在必要關聯，且其水平變化受病情程度影響，因此可通過對其水平的檢測有效評估病情，臨床應用價值較高。

3.2 炎癥因子在支氣管哮喘發病中的作用

本研究顯示，支氣管哮喘患兒血清TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均高于健康兒童，IFN-γ、CD8+、CD3+、CD4+水平均低于健康兒童，說明支氣管哮喘的發生與機體炎癥反應、免疫功能存在關聯。氣道重塑與氣道炎癥是支氣管哮喘中最常見的病理變化。研究顯示，TGF-β1作為強烈致纖維化作用因子，是氣道重塑的實質，可有效刺激氣道平滑肌細胞[11]。IFN-γ對細胞免疫反應具有介導作用，能夠減輕哮喘氣道炎癥。相關研究表明，肺組織缺氧導致HIF-1α降解減少和轉錄增加，造成氣道痙攣、氣管壁平滑肌細胞機械張力增加[12]。VEGF作為血管新生正調控因子，對血管內皮細胞增殖具有促進作用，同時對血管通透性的增加具有促進效果，在呼吸道炎癥和重塑中發揮重要作用。T淋巴細胞亞群作為臨床常用免疫檢測指標，其水平變化顯示患者機體免疫情況。CD3+能夠反映機體免疫能力，其高表達表示機體免疫能力增強；CD4+對細胞炎癥反應具有刺激或介導作用；CD8+屬于細胞毒性T細胞[13]。本研究顯示，支氣管哮喘患兒機體炎癥反應明顯高于健康者，免疫功能較低，同時通過對不同程度病情觀察發現，機體炎癥反應狀態隨病情發展而升高，機體免疫能力隨病情發展而降低，提示炎癥因子在支氣管哮喘病情進展中發揮重要作用，并對機體免疫能力造成影響。

綜上所述，檢測Periostin、IL-13、miR-155水平對支氣管哮喘患兒的診斷及預后具有重要意義，且其水平在支氣管哮喘中具有一定的相關性，可為支氣管哮喘臨床診斷提供一定參考依據。