高低峰值骨量人群生物標(biāo)志物差異及其在骨質(zhì)疏松中的診療價值

林適 袁嘉堯 林賢燦 楊彬彬 林燕平 黃佳純 連曉航 萬雷 黃宏興*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510240

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種與年齡相關(guān)，以骨強度下降為特征的全身性骨骼疾病[1]。OP發(fā)病機制主要是成骨和破骨進程間的平衡被打破，骨吸收增加而骨形成減少，從而導(dǎo)致骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)惡化，骨脆性增加，以致骨折發(fā)生率升高[1-2]。OP是老年人骨折最常見的原因，OP相關(guān)性骨折好發(fā)于脊柱、髖部及腕部，構(gòu)成巨大的醫(yī)療、公共衛(wèi)生和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[2-3]。由于人口老齡化的加劇和過去二三十年來我國生活方式的巨大變化，OP患者數(shù)量預(yù)計在不久的將來會激烈增長，我國公共衛(wèi)生將面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[4]。高通量技術(shù)的最新進展使許多生物化學(xué)骨生物標(biāo)志物的識別成為可能，有助于OP患者的診斷和管理[5]。目前，確定更多有用的生物標(biāo)志物或靶標(biāo)，以改善OP的診斷和管理仍是當(dāng)務(wù)之急[6]。

峰值骨量(peak bone mass，PBM)是人體整個生長發(fā)育期最大的骨積累量，是個體未來骨質(zhì)疏松癥和骨折風(fēng)險的重要預(yù)測指標(biāo)[7]。一般來說，男性和女性的骨量在前20年顯著增加，并在青春期晚期或青年期達到穩(wěn)定[8]。成人的骨量等于成年早期的峰值骨量減去成年后的骨質(zhì)流失量，提高PBM對于預(yù)防或者延緩OP發(fā)病的重要性不言而喻。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，PBM值每增加10%，可使50歲后骨折風(fēng)險降低50%[9]。低PBM值與更高的OP發(fā)病率和骨折風(fēng)險相關(guān)，而因為高PBM值能夠為成年人和老年人提供更大量的骨質(zhì)儲備及更高的骨強度，能明顯減少或延遲OP的發(fā)生[8]。因此，如何在兒童及青少年時期實現(xiàn)PBM值的提高，為中老年時期提供更高的骨量儲備，實現(xiàn)高骨密度和骨強度積累更有利于OP及OP相關(guān)骨折的預(yù)防是目前的一個熱門研究話題。

目前大多數(shù)研究都著眼于骨質(zhì)疏松人群和健康人群生物標(biāo)志物的差異，鮮有研究分析高低峰值骨量人群生物標(biāo)志物差異。鑒于峰值骨量在骨質(zhì)疏松發(fā)病及防治中的重要地位，本研究基于生物信息手段分析高低峰值骨量人群間生物標(biāo)志物的差異，并研究其在骨質(zhì)疏松診斷治療中的價值。

1 資料和方法

1.1 高低峰值骨量基因芯片下載

通過基因組學(xué)存儲數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.gov/gds)檢索“osteoporosis”“peak bone mass”等關(guān)鍵詞，設(shè)置樣本來源為人，得到符合條件的數(shù)據(jù)集GSE7158，平臺文件為：GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。該數(shù)據(jù)集招募了878名20～45歲的健康中國女性，平均27.3歲，使達到并維持峰值骨量，根據(jù)PBM表型分布進行受試者篩選，最后分別選中12名極低和14名極高PBM受試者進行測序分析。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異表達分析

通過Perl腳本(www.perl.org/)處理下載得到的數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)，并獲得基因表達矩陣文件。利用R軟件中的limma工具包進行差異表達基因(DEGs)篩選。DEGs篩選標(biāo)準(zhǔn)為：∣logFC∣>2并且P<0.01。

1.3 GO功能和KEGG信號通路分析

為了明確篩選得到的差異基因的生物學(xué)作用，利用R語言中的clusterProfiler工具包進行差異基因GO(gene ontology)功能富集分析。GO是基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系，它旨在建立適用于各種物種的，對基因和蛋白質(zhì)功能進行限定和描述的，并能隨著研究不斷深入而更新的語言詞匯標(biāo)準(zhǔn)[10]。GO分為分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組成(cellular component，CC)3個部分[10]。采用KOBAS 3.0在線工具(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)進行KEGG通路富集分析[11]。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因篩選

通過String數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)進行差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析[12]，設(shè)置去除無連接的節(jié)點，得到PPI網(wǎng)絡(luò)可視化圖譜及PPI網(wǎng)絡(luò)注釋文件。將注釋文件導(dǎo)入Cytoscape(版本3.7.1)軟件中，并利用cytoHubba插件10種算法計算網(wǎng)絡(luò)種節(jié)點得分[13]。利用R語言中的UpSetR工具包對每個算法分值最高的前25個基因進行交叉驗證，最終得到各個算法均定義為關(guān)鍵基因的列表。然后再進行關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)絡(luò)可視化展示。

1.5 關(guān)鍵基因主成分分析及組間表達比較

為進一步明確篩選得到的關(guān)鍵基因是否能夠代表高低峰值骨量人群基因表達的差異，本研究進行了關(guān)鍵基因在高低峰值骨量兩組人群間的表達主成分分析(principal component analysis，PCA)。PCA是多元統(tǒng)計中的一種統(tǒng)計方法，是最常用的線性降維方法，具有降低數(shù)據(jù)維度同時保留較多的原始數(shù)據(jù)點的特性[14]。本研究中PCA的運用，可以有效降低基因表達特征集維數(shù)的同時，也可以很好地解釋各個基因表達特征集與不同樣本的相關(guān)性。

1.6 關(guān)鍵基因和骨質(zhì)疏松的相關(guān)性

為驗證關(guān)鍵基因和骨質(zhì)疏松之間的相關(guān)性，從GEO數(shù)據(jù)庫中以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞，設(shè)置樣本來源為人，檢索并下載得到基因表達數(shù)據(jù)集GSE35959，平臺文件和高低骨量數(shù)據(jù)集為同一平臺(GPL570)，通過該數(shù)據(jù)集驗證關(guān)鍵基因在骨質(zhì)疏松患者和健康者之間的表達差異。

2 結(jié)果

2.1 高低峰值骨量人群差異表達基因篩選

通過R語言中的limma工具包進行差異表達基因篩選，設(shè)置篩選條件為：∣logFC∣>2并且P<0.01。通過分析，一共得到182個差異基因，其中73個下調(diào)差異基因，109個上調(diào)差異基因，差異表達熱圖見圖1A及火山圖見圖1B。

2.2 差異基因GO和KEGG富集分析結(jié)果

為發(fā)掘差異基因的生物學(xué)作用，采用R語言中的clusterProfiler工具包進行了GO功能注釋，對各GO功能顯著性靠前的5條功能注釋進行展示(圖2)，KOBAS3.0在線工具進行了KEGG通路富集分析，并進行相似通路聚類分析(圖3)。差異基因GO功能注釋結(jié)果顯示，生物過程主要涉及DNA的復(fù)制、氨基酸的生物合成、脫氧核糖核酸酶活性的調(diào)控和蛋白質(zhì)泛素化的負(fù)調(diào)控等；細胞組分主要定位在基底外側(cè)質(zhì)膜、神經(jīng)元細胞體膜、細胞體膜、核復(fù)制叉和MCM復(fù)合體等；分子功能主要涉及蛋白磷酸酶結(jié)合、病毒受體活性、外源性蛋白結(jié)合、錯配修復(fù)復(fù)合物結(jié)合和磷酸酶結(jié)合等。KEGG富集分析結(jié)果顯示富集通路分成8個聚類，值得注意的是，C1聚類中的破骨細胞分化通路(osteoclast differentiation)、C3聚類中的PI3K-AKT信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、C7聚類中的糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)和其他聚類中的鐵死亡信號通路(Ferroptosis)。

圖3 KEGG通路富集分析Fig.3 KEGG pathways enrichment of DEGs

2.3 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)建立及分析

將所有差異基因名稱導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫中，按照默認(rèn)設(shè)置并選擇去除無連接節(jié)點，構(gòu)建差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)(圖4)。將PPI注釋文件導(dǎo)入Cytoscape軟件中，利用cytoHubba插件計算PPI網(wǎng)絡(luò)中10種算法下各節(jié)點分值，利用R語言中的UpSetR工具包進行交叉驗證得到11個關(guān)鍵基因(圖5A)，然后提取11個關(guān)鍵基因相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖5B)：節(jié)點顏色越深代表其在網(wǎng)絡(luò)中的degree值越高。其中CDK16為下調(diào)差異基因，其他為上調(diào)差異基因。

圖4 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 PPI network analysis of DEGs

圖5 關(guān)鍵基因篩選Fig.5 Identification of key genes

2.4 關(guān)鍵基因主成分分析

為進一步明確篩選得到的關(guān)鍵基因是否能夠代表高低峰值骨量人群基因表達的差異，本研究進行了關(guān)鍵基因在高低峰值骨量人群間表達水平的PCA分析。PCA分析顯示組間差異顯著，說明關(guān)鍵基因可以將高低峰值骨量人群區(qū)分開(圖6)。

圖6 關(guān)鍵基因在高低峰值骨量人群間表達水平的PCA分析Fig.6 Results of principal component analysis

2.5 關(guān)鍵基因和骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性

為驗證關(guān)鍵基因和骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性，通過下載和高低峰值骨量人群基因表達芯片為同一平臺文件(GPL570)的數(shù)據(jù)集GSE35959，進行關(guān)鍵基因表達水平驗證，探究關(guān)鍵基因在骨質(zhì)疏松患者和健康者之間的表達差異。GSE35959包含了5例骨質(zhì)疏松患者和14名健康者的基因表達數(shù)據(jù)。通過驗證發(fā)現(xiàn)CCR5、CDK16、RBBP7和SRSF7在骨質(zhì)疏松患者和健康者中表達水平差異顯著(圖7)。另外，主成分分析也顯示這4個基因在骨質(zhì)疏松患者和健康者組間差異顯著，組內(nèi)差異較小，能顯著區(qū)分OP人群和健康人群(圖8)，具有潛在的診療價值。

圖7 驗證關(guān)鍵基因與OP患者中的表達水平Fig.7 Validation of expression level of key genes in OP patients

圖8 4個驗證基因主成分分析Fig.8 Principal component analysis of 4 validated genes

3 討論

隨著高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展，基因芯片分析已經(jīng)成為識別疾病和健康狀態(tài)間差異表達基因的有效方法，是識別疾病相關(guān)生物標(biāo)志物、作用途徑以及藥物靶標(biāo)的強大技術(shù)手段[15-16]。多項研究利用基因芯片分析確定了骨質(zhì)疏松發(fā)病機制中的關(guān)鍵基因，有助于更準(zhǔn)確地識別骨質(zhì)疏松發(fā)病中基因生物標(biāo)志物。Xia等[17]通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)VPS35、PHF20、NFKB2和HIRA在骨形成和骨代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可以作為潛在的診斷及治療靶點。Qian等[18]通過WGCNA等生物信息學(xué)方法對基因芯片進行分析，確定PPWD1可以作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松潛在診斷生物標(biāo)志物。Zhang等[19]研究通過mRNA和lncRNA芯片分析，揭示了JUN和ACSL5可能是骨質(zhì)疏松潛在生物標(biāo)志物和臨床治療靶點，并構(gòu)建了骨質(zhì)疏松ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病往往呈隱匿性，早期階段并不出現(xiàn)相關(guān)癥狀，以致不容易被發(fā)現(xiàn)及早期治療。對于高低峰值骨量人群生物標(biāo)志物的差異分析，并發(fā)掘其在骨質(zhì)疏松癥中的潛在診療價值具有重要意義。本研究充分發(fā)揮生物信息學(xué)優(yōu)勢，對GEO數(shù)據(jù)庫中高低峰值骨量人群的基因表達芯片進行了分析，最終篩選得到182個差異基因，其中73個下調(diào)差異基因，109個上調(diào)差異基因。GO和KEGG富集分析顯示，這些差異基因可以通過多個生物進程及信號通路發(fā)揮作用。值得注意的是，KEGG通路分析結(jié)果中C1聚類的破骨細胞分化通路、C3聚類的PI3K-AKT信號通路、C7聚類的糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路和其他聚類的鐵死亡信號通路和骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制密切相關(guān)。林院等[20]研究表明丹酚酸B能夠通過激活PI3/AKT信號通路，上調(diào)MC3T3細胞ALP、OPN、COLⅠ和OCN表達，刺激MC3T3細胞骨形成。Li等[21]證實miR-363-3p可以通過激活PI3K/AKT信號通路，促進破骨細胞分化，抑制成骨細胞分化，促進骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病。AGE-RAGE間相互作用可以影響細胞功能、運動和新陳代謝，與骨重塑過程密切相關(guān)[22]。Yi等[23]研究發(fā)現(xiàn)莫諾苷可以通過抑制AGE-RAGE信號通路減輕高糖介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞功能障礙，并可能成為糖尿病骨質(zhì)疏松癥的潛在治療手段。鐵死亡是最近的研究熱點[24]，越來越多的研究關(guān)注鐵死亡途徑在骨質(zhì)疏松癥防治中的作用機制。Yang等[25]的研究中通過體內(nèi)和體外實驗證實，內(nèi)皮細胞分泌的外泌體可以通過抑制鐵蛋白吞噬依賴性的鐵死亡，逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥。Ni等[26]全面研究了破骨細胞鐵死亡的體內(nèi)外作用，發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控HIF-1α和鐵蛋白，誘導(dǎo)破骨細胞鐵死亡可能是治療骨質(zhì)疏松癥的一種替代療法。

本研究通過對差異基因進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，確定了11個在高低峰值骨量人群中差異表達的關(guān)鍵基因，PCA分析顯示關(guān)鍵基因在高低峰值骨量兩組組間差異顯著，能顯著區(qū)分高低峰值骨量人群。另外，通過進一步驗證發(fā)現(xiàn)CCR5、CDK16、RBBP7和SRSF7在骨質(zhì)疏松患者和健康者中表達水平差異顯著；同時，PCA也顯示這4個基因在骨質(zhì)疏松患者和健康者組間表達差異顯著，組內(nèi)差異較小，具有潛在診療價值。CCR5可以通過調(diào)節(jié)破骨細胞功能，抑制骨吸收。Lee等[27]通過體外實驗證實敲除CCR5表達，可抑制破骨細胞活性及骨吸收過程，抵抗RANKL誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。CDK16是細胞周期依賴激酶家族中的一員，參與轉(zhuǎn)錄及細胞周期的調(diào)節(jié)[28]。RBBP7是組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑復(fù)合體成員之一，具有調(diào)節(jié)細胞周期和細胞增殖分化功能[29]。SRSF7是富含絲氨酸/精氨酸(SR)蛋白家族中的一員，調(diào)節(jié)各種mRNA前體的組成剪接和選擇性剪接，在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[30]。目前為止，未有直接證據(jù)表明CDK16、RBBP7和SRSF7參與調(diào)控骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程，是未來的潛在研究方向。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定了高低峰值骨量人群生物標(biāo)志物的差異，并通過進一步驗證發(fā)現(xiàn)差異標(biāo)志物中CCR5、CDK16、RBBP7和SRSF7可能與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病密切相關(guān)。這4個差異表達基因有可能成為早期篩選骨質(zhì)疏松癥高風(fēng)險人群的生物標(biāo)志物，對骨質(zhì)疏松癥的防治發(fā)揮重要作用。與此同時，本研究存在一些局限性，例如：GEO芯片樣本量不足，缺乏實驗證據(jù)支持。但是，本研究利用生物信息學(xué)的優(yōu)勢，發(fā)掘了潛在的生物標(biāo)志物，為后續(xù)進一步實驗研究及臨床治療提供了有效依據(jù)。