紅花水提液對博來霉素誘導的系統性硬皮癥小鼠皮膚和肺纖維化的影響▲

李永強 黃奕 周雪艷 趙亮娟 呂軍影

1 廣西醫科大學第一臨床醫學院，南寧市 530021；2 廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧市 530021

系統性硬化癥(SSc)是一種自身免疫性風濕性疾病，其主要特征是機體出現嚴重的多系統結締組織纖維化。間質性肺疾病(ILD)是SSc患者的常見并發癥，是患者最常見的死亡原因，患者預后差[1]。系統性硬化相關性ILD(SSc-ILD)的發病機制目前尚不清楚，非選擇性免疫抑制劑如環磷酰胺、霉酚酸酯和硫唑嘌呤是臨床治療SSc-ILD患者的常用藥物[1]。一些研究結果[2-3]顯示，活血化瘀中藥治療能較好地改善機體的肺纖維化，其中紅花是最常用的活血化瘀藥物之一。本課題組的前期研究結果顯示，紅花水煎液能明顯降低SSc小鼠肺組織的羥脯氨酸含量，具有很好的抗肺纖維化作用[4]。博來霉素誘導的SSc小鼠的典型特征是皮膚和肺組織發生明顯的病理學改變，皮膚真皮顯著增厚、硬化，伴肺組織Ⅰ型膠原(COLI)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)過度表達，與人類SSc患者的組織學特征非常相似[5-7]。為探討紅花水提液的抗纖維化作用機制，本研究觀察了紅花水提液對博來霉素誘導的SSc小鼠肺組織COLI、α-SMA表達水平等的影響。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 24只7周齡近交系BALB/C小鼠，SPF級，雌性，體重(20±2)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2019-0004。小鼠在廣西醫科大學實驗動物中心室溫20～25℃、相對濕度50%～70%的清潔環境中分籠飼養，光/暗12h循環；小鼠可自由獲取食物和水。本實驗方案及操作經廣西醫科大學動物實驗委員會審查批準，符合實驗動物倫理學要求。

1.2 主要藥物和試劑 (1)將注射用鹽酸博來霉素(浙江海正藥業股份有限公司)溶于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，制成200 μg/mL緩沖液，過濾除菌后分裝于EP管中，4℃保存備用。(2)將中藥紅花(批號190701921，產地四川，購自廣西醫科大學第一附屬醫院藥房)采用常規方法加水煎煮并濃縮成1 g/mL的紅花水提液，使用純水配制成濃度為0.15 g/mL的使用液，4℃保存備用。(3)RNAwait(非凍型組織RNA保存液)購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗小鼠COLI多克隆抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司，兔抗小鼠α-SMA抗體購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器 Olympus正置四色熒光顯微鏡(型號：BX53)； StepOneTM熒光定量 PCR 儀；Centrifuge 5417C高速冷凍離心機(Eppendorf)；JY300E通用電泳儀(北京君意)；NanoDrop2000c(Thermo Scientific)。

1.4 方法 小鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字法分為對照組、模型組、紅花干預組，每組8只。參照文獻[8]剃去各組小鼠背部中央區相同部位面積約2 .0 cm×2.0 cm的被毛，對照組小鼠在背部脫毛區皮下注射PBS 0.1 mL，1次/d；模型組、紅花干預組小鼠在背部脫毛區皮下注射博來霉素磷酸鹽緩沖液(200 μg/mL)0.1 mL，1次/d，三組小鼠均連續注射28 d。紅花干預組小鼠從皮下注射博來霉素開始后，給予紅花使用液0.2 mL/d灌胃，連續灌胃28 d；對照組和模型組小鼠給予等容量生理鹽水灌胃，連續灌胃28 d。干預期間，各組小鼠自由飲水進食。干預結束后，小鼠自由飲水進食1天，禁食不禁水1天，第3天，給所有小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉處死，取背部注射區皮膚及肺組織，一部分采用4%多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續切片；一部分放入EP管中，加入適量的非凍型組織RNA保存液，-80℃保存，用于q-PCR檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況 比較三組小鼠干預期間的活動度、背部注射區皮膚及脫毛區毛發生長情況、反應度、體重等。

1.5.2 皮膚和肺組織病理學檢查 取小鼠皮膚、肺組織切片行HE染色和Masson染色，光學顯微鏡下觀察皮膚和肺組織病理學改變。參照文獻[9]，對肺組織切片進行肺纖維化程度評分。

1.5.3 肺組織 COLI、α-SMA表達情況 采用免疫組化SABC法檢測小鼠肺組織的COLI、α-SMA表達情況，采用Image Pro Plus軟件進行定量分析。COLI、α-SMA蛋白陽性判定標準：以胞質內呈現棕黃色顆粒為陽性反應，反之為陰性反應；隨機選取6個高倍視野(×400)，用Image Pro Plus軟件檢測每個視野下染色區域的光密度，計算平均光密度(AOD)=累積光密度/陽性面積。

1.5.4 肺組織COLI-a1、COLI-a2、α-SMA的mRNA表達水平 參照試劑盒說明書，采用q-PCR檢測小鼠肺組織COLI-a1、COLI-a2、α-SMA表達水平。COLI-a1、COLI-a2、α-SMA的mRNA相對表達量分析采用循環數(Ct)值法(2-△△Ct法，熒光強度達閾值時)，即相對表達量=2-△△Ct，△Ct=Ct目標基因-Ct內參基因，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。由北京擎科生物科技有限公司設計并合成PCR引物序列。

引物序列：

COLI-a1 F(AGCACGTCTGGTTTGGAGAG)

R(GACATTAGGCGCAGGAAGGT)

COLI-a2 F(TACAACGTAGAAGGGGTGTCCT)

R(TGCAGTGGTAGGTGATGTTCTG)

α-SMA F(CCAGCCATCTTTCATTGGGATG)

R(ACAGGACGTTGTTAGCATAGAGA)

內參基因：F(ACTCTTCCACCTTCGATGCC)

R(TGGGATAGGGCCTCTCTTGC)

1.6 統計學處理 采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以x±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組小鼠干預期間的一般情況比較 干預過程無小鼠死亡。對照組小鼠精神好，反應靈敏，飲水和進食正常，體質量增加，背部注射區皮膚輕度增厚、無硬化現象，脫毛區毛發生長迅速，大便軟硬適中、量正常；模型組小鼠精神差、活動性差，體質量下降明顯，背部注射區皮膚硬化明顯，飲水進食減少，大便干硬、量偏少；紅花干預組小鼠精神較模型組好，活動性好，脫毛區毛發有不同程度生長，體質量輕度下降。三組小鼠的體質量變化見圖1。

圖1 三組小鼠干預期間的體質量變化情況比較

2.2 三組小鼠皮膚和肺組織的病理學變化情況比較 干預結束后第3天處死小鼠。對小鼠皮膚進行HE染色和Masson染色檢查，結果顯示：(1)對照組小鼠皮膚組織結構完整，可見零星散在的少量炎癥細胞。(2)模型組小鼠皮膚真皮層明顯增厚，膠原纖維明顯增粗、膨大、數量增多、排列緊密、呈均質化改變，可見大量炎癥細胞浸潤，包括淋巴細胞、組織細胞和少許漿液，脂肪組織并入到真皮內；皮膚附屬器萎縮，減少。(3)與對照組比較，紅花干預組小鼠皮膚真皮層增厚，少量淋巴細胞浸潤，膠原纖維排列紊亂，數量增多；與模型組比較，小鼠皮膚真皮層變薄，淋巴細胞等炎癥細胞浸潤減少，膠原纖維數量減少。見圖2、圖3。 肺組織HE染色和Masson染色檢查結果顯示：(1)對照組小鼠肺泡結構完整，無明顯膠原纖維增生，可見散在的少量炎癥細胞。(2)模型組小鼠肺部結構破壞、紊亂，肺泡間隔斷裂，肺泡內出血，肺間質、肺泡和支氣管壁可見大量炎癥細胞浸潤，膠原纖維增厚。(3)紅花干預組小鼠肺泡間隔輕中度增厚，少量中等量炎癥細胞浸潤，膠原纖維增生。見圖4、圖5。

圖2 三組小鼠皮膚HE染色(×200， A為對照組，B為模型組，C為紅花干預組)

圖3 三組小鼠皮膚Masson染色(×200，A為對照組，B為模型組，C為紅花干預組)

圖4 三組小鼠肺組織HE染色(×200，A為對照組，B為模型組，C為紅花干預組)

圖5 三組小鼠肺組織Masson染色(×200， A為對照組，B為模型組，C為紅花干預組)

2.3 三組小鼠的肺纖維化程度評分比較 干預結束后第3天處死小鼠。對小鼠肺組織進行HE染色和Masson染色檢查，結果顯示：模型組、紅花干預組小鼠肺纖維化程度評分顯著高于對照組，紅花干預組小鼠肺纖維化程度評分顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.001)。見圖6。

圖6 三組小鼠的肺纖維化程度評分比較

2.4 三組小鼠肺組織的COLI、α-SMA表達水平比較 對照組小鼠肺組織中的COLI、α-SMA呈微弱表達；模型組小鼠肺組織中的COLI、α-SMA呈強陽性表達；紅花干預組小鼠肺組織中的COLI、α-SMA呈中等強度陽性表達。見圖7、圖8。模型組、紅花干預組小鼠肺組織的COLI、α-SMA表達水平(肺組織的AOD)顯著高于對照組，紅花干預組小鼠肺組織COLI、α-SMA表達水平顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖7 三組小鼠肺組織COLI的表達情況(×400，A為對照組，B為模型組，C為紅花干預組)

圖8 三組小鼠肺組織a-SMA的表達情況(×400，A為對照組，B為模型組，C為紅花干預組)

表1 三組小鼠肺組織的AOD比較 (n, x±s)

2.5 三組小鼠肺組織COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表達水平比較 模型組小鼠肺組織的COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表達水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；紅花干預組小鼠肺組織的COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表達水平顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖9。

圖9 三組小鼠的肺組織COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表達水平比較

3 討 論

SSc-ILD被認為是纖維化、自身免疫、炎癥和血管損傷相互作用的結果，其特征是肺組織成纖維細胞、肌成纖維細胞數量顯著增加，細胞外基質堆積，導致機體發生慢性呼吸衰竭或致死性肺動脈高壓[10-11]。活化的成纖維細胞和肌成纖維細胞是肺纖維化的關鍵效應細胞，在肺纖維化過程中，成纖維細胞被激活、增殖和分化為對細胞因子、趨化因子和生長因子等高度敏感的肌成纖維細胞，從而刺激細胞外基質的過度產生，細胞外基質中的纖維性蛋白如Ⅰ型和Ⅲ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等比例增高，最終發生纖維化[12-14]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是判斷肌成纖維細胞活化水平最常用的標志物[15-17]。

目前，臨床上對SSc-ILD患者一般給予免疫調節治療，但非選擇性免疫抑制劑具有毒性，短期使用可導致白細胞減少和感染，而長期使用可能會導致不孕、發生骨髓毒性和致癌。目前所研發的針對器官組織的特異性抗纖維化藥物很少直接針對肌成纖維細胞，更多的是針對調節激活信號或細胞內級聯的藥物，因此，針對肝、腎或肺肌成纖維細胞的藥物靶向治療研究是一個新的方向[17-18]。

中藥紅花，又名刺紅花、懷紅花、草紅花和金紅花，為菊科植物紅花的干燥花，其味辛性溫，歸心、肝經，有活血通經、祛瘀止痛的功效。紅花含有黃酮、生物堿、聚炔、亞精胺、甾醇、木脂素、多糖等多種成分，具有抗心肌缺血、調節血流動力學、抗炎、抗氧化、調節免疫等藥理作用[19]。一些研究結果顯示，活血化瘀類中藥能較好改善患者的肺纖維化狀況，中藥紅花具有抗肺纖維化的作用[20-23]。

本研究結果顯示，紅花水提液可明顯改善SSc小鼠皮膚和肺組織的病理學狀況，減少皮膚和肺組織的炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積，降低小鼠肺纖維化程度，提示紅花水提液具有較好的抗纖維化作用；紅花水提液可下調SSc小鼠肺組織的COLI、α-SMA表達水平以及COLI-a1mRNA、COLI-a2 mRNA、α-SMA mRNA表達水平，提示紅花水提液可能是通過降低COLI、α-SMA含量，減少肌成纖維細胞及細胞外基質的生成和堆積而發揮抗纖維化的作用。