沉默SMAD4降低MIA PaCa-2細胞對吉西他濱的敏感性

安倩 曹雪婷 吳博雅 陳靜

摘要：目的探究SMAD4基因缺失后對胰腺癌MIA PaCa-2細胞的增殖、遷移和侵襲的影響。方法應用實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡實驗檢測SMAD4基因的mRNA和蛋白水平的表達。CCK8方法檢測不同濃度吉西他濱對MIA PaCa-2細胞的毒性作用，進而選取最佳作用濃度。同時，臺盼藍實驗檢測吉西他濱在不同時間作用下對MIA PaCa-2細胞存活率的影響，進而選取最佳作用時間。最后，通過Transwell實驗檢測基因沉默與藥物共同作用下對細胞遷移和侵襲的影響。結果吉西他濱作用MIA PaCa-2細胞最佳濃度為10-7 M、最佳時間是48 h。與對照組相比，敲除SMAD4基因后吉西他濱作用的MIA PaCa-2細胞的存活率有所上升，且通過小室的轉染組細胞數明顯高于無轉染組細胞數。結論吉西他濱能抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲，且SMAD4基因敲除后使胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力明顯增加，以及敲除后能部分抑制吉西他濱對胰腺癌細胞的殺傷作用。

關鍵詞：SMAD4;胰腺癌;吉西他濱

【中圖分類號】 F763 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）10--02

胰腺癌（PC）是當前惡性程度相當高并迅速致命的難治性胃腸道癌癥之一，其發病率在世界范圍內也呈現出增加的態勢，但在我國患者中出現時多數已是為晚期，死亡率幾乎100%。最新的檢測結果、流行病學和最終結論估計，在胰腺癌所有階段的總體五年生存率僅為10%（2010-2016年）[1]。自1997年，吉西他濱（GEM）首次被證實其對胰腺癌的化療效果較之以前一直應用的氟尿嘧啶有優越性以來，在針對胰腺癌的化療中，無論是單獨應用或聯合應用，吉西他病一直作為一線首選用藥[2]。

SMAD4基因最初是基于胰腺腫瘤中頻繁的18q21.1純合缺失和突變而被發現的，并被發現參與了TGF-β的信號通路。SMAD4基因在多種惡性腫瘤種類中缺失或突變，如胰腺癌、結腸癌、食管癌、胃癌和肝癌，特別是消化系統腫瘤。因此，它被認為是一種腫瘤抑制基因[3]。目前的文獻中對于SMAD4的缺失是否與胰腺癌的對吉西他濱的敏感性相關，缺乏一定的數據支持和研究。所以，本研究旨在探討SMAD4基因缺失后吉西他濱對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1材料與方法

1.1細胞培養

胰腺癌細胞株MIA PaCa-2細胞（購自武漢普諾賽生命科技有限公司）。用含10%胎牛血清（Gibco），37℃、5%CO2培養箱中培養。當融合度達到80～90%時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2 CCK8實驗

本研究使用CCK8法測定抑制率。細胞接種于96孔板（8000個細胞/孔），每孔100μL，培養24 h后，分別加入含有10-11 M～10-3 M的GEM的無血清培養基，37℃、5%CO2培養箱培養48 h，在450 nm波長測定OD值。并計算IC50值（50%抑制濃度，也稱半抑制濃度），從而選出最佳濃度。

1.3臺盼藍排斥實驗

使用臺盼藍排斥實驗篩選出最佳作用時間。細胞以20×105個/孔均勻鋪在六孔板中，在37℃、5%CO2培養24 h后，加入10-7 M的GEM無血清培養基，每個藥物濃度設3個復孔。繼續培養24 h、48 h、72 h后，制成50 uL的細胞懸液，加入50 uL 0.5%臺盼藍染液，染色3 min，再用倒置顯微鏡下觀察細胞著色情況，將死細胞染成藍色，活細胞不染色，計算不同時間的存活率。

1.4細胞轉染

SMAD4基因的siRNA（陰性對照、、陽性對照、三組siRNA）從吉瑪基因購買。引物序列分別為：

陰性對照（F：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，

R：5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3），

2140（F：5-GCUCCUAGACGAAGUACUUTT-3，R：5-AAGUACUUCGUCUAGGAGCTT-3）、

1045（F：5-GCCAUCGUUGUCCACUGAATT-3，R：5-UUCAGUGGACAACGAUGGCTT-3）、

1306（F：5-GCCAGCUACUUACCAUCAUTT-3，R：5-AUGAUGGUAAGUAGCUGGCTT-3）。

將MIA PaCa-2細胞接種于6孔板（5.0x105個/孔）中24 h后，使第二天細胞密度高達到70%～90%。MIA PaCa-2細胞轉染前24 h分為兩組：i）陰性對照亞組、1306亞組、2140亞組、1045亞組;ii）陰性對照（0.1%PBS）亞組、陰性對照+GEM（10-7M）亞組、si-SMAD4亞組、si-SMAD4+GEM（10-7M）亞組。每組設置三個復孔。HighGene轉染試劑（ABclonal）瞬時轉染。轉染24 h后，進行qPCR實驗，轉染48 h后，進行Western blot實驗。

1.5實時熒光定量PCR（qPCR）分析

用成都福際RNA提取試劑盒（RE-03012）在細胞中分離總RNA。使用莊盟公司提供的第一鏈反轉錄試劑盒（ZR102-1），得到cDNA。使用以下參數在ABI PRISM 7500FAST PCR序列檢測系統上進行qPCR測定：95℃3min，95℃5s，60℃34s，共40個循環。靶基因倍數變化用2-ΔΔCt法計算。用于qPCR的引物如下：

SMAD4（F：5-CTCCCATCCAATGTTCTCTGTA-3，

R：5-ACAAGTAATGATGCCTGTCTGA-3;

GAPDH：F：5-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3，

R：5-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3。

1.6 Western blot分析

用細胞裂解液（每1 mL RIPA裂解液加入2 uL的蛋白酶抑制劑）從培養細胞中提取總蛋白。4℃下12000 rpm離心10 min。BCA蛋白定量試劑盒（美侖生物）檢測蛋白濃度。用10%的SDS-PAGE分離蛋白質，并轉移到PVDF膜上，再用配好的5%脫脂牛奶封閉2 h，使用兔抗SMAD4孵育一抗（1：2，000，ThermoFisher），再移至4℃冰箱過夜。膜用TBST清洗3次。然后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（1：10，000;ABclonal）作為二次抗體孵育。通過增強化學發光（ECL;Thermo Fisher Science）對斑點進行可視化。ECL系統（amersham;GE Healthcare）用于檢測條帶，最后用Image J軟件分析。

1.7 Transwell細胞遷移和侵襲實驗

24孔板下室加入600?L含20%FBS的完全培養基，取100?L細胞密度為2×105/mL的懸液加入transwell小室上室（注意：侵襲實驗的小室需用50?L matrigel膠稀釋液包被transwell小室底部膜的上室，37℃，1 h）。37℃，5%CO2培養24 h后加入10-7 M濃度的吉西他濱，每組設三個復孔。培養48 h后，Gimsa染色，顯微鏡下觀察，拍照，取五個視野計算平均數。

1.8統計學分析

所有實驗均獨立重復3次，分析結果均以平均值±標準差顯示。數據結果通過單因素方差分析、t檢驗完成，各數據使用SPSS 13.0統計學分析軟件，并通過Graphpad prism 8.0和Image J軟件處理分析。P<0.05時，具有統計學意義。

2實驗結果

2.1吉西他濱對MIA PaCa-2細胞的毒性作用

CCK8法檢測藥物對細胞的毒性作用，以便篩選出最佳作用濃度。MIA PaCa-2細胞中加入不同濃度的GEM作用48 h后，GEM以濃度依賴性降低胰腺癌細胞的存活率。進而得出IC50為-7.07±0.38，故選擇GEM作用MIA PaCa-2細胞的最佳濃度為10-7 M。同時，進行臺盼藍實驗測定10-7 M濃度的GEM對MIA PaCa-2細胞在0 h、24 h、48 h、72 h的抑制作用，從而選擇出最佳的作用時間。得出結果為細胞存活率分別為96.40±0.75、71.45±3.00、36.69±3.67、21.69±2.04，GEM以時間依懶性降低MIA PaCa-2細胞的存活率，根據存活率結果選取48 h為GEM作用細胞的最佳時間。

2.2敲低SMAD4基因降低吉西他濱對胰腺癌細胞的作用

2.2.1沉默SMAD4基因抑制吉西他濱對細胞的毒性作用

首先，通過吉瑪基因設計了SMAD4基因的三個不重疊siRNA，被命名為：“2140”、“1045”和“1306”。qPCR和Western Blot實驗分析“1306”的轉染效率最高，可達到70%以上（圖1）。故以下實驗使用“1306”這一siRNA轉染。

用10-9 M～10-5 M濃度的GEM作用細胞48 h，進行CCK8細胞毒性檢測。從圖2看出，轉染組的細胞存活率比對照組明顯上調（P<0.05），說明較高濃度的GEM和siRNA聯合使用比只使用GEM對細胞殺傷作用有所減弱，進一步說明敲低SMAD4的胰腺癌細胞下調GEM的敏感性。

2.2.2轉染siRNA降低吉西他濱抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲

為進一步驗證SMAD4基因與GEM對胰腺癌細胞遷移侵襲的影響，用10-7 M濃度的GEM對轉染和不轉染siRNA的MIA PaCa-2細胞作用48 h，進行Transwell細胞遷移和侵襲實驗。由表1可看出，與PBS組相比，加藥組細胞遷移和侵襲的細胞數明顯降低，但轉染組相較于無轉染組的遷移侵襲細胞數是上調的。說明GEM能抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲作用，同時轉染siRNA后，GEM的抑制作用明顯下調。綜上所述，沉默SMAD4基因后，GEM的治療作用受到抑制，且明顯降低了GEM對胰腺癌細胞的遷移侵襲的抑制作用。

3. 討論

胰腺癌是人類惡性癌癥中高致死性的病變，它起病隱匿，發展較快，治療效果和預后都很差，預測到2030年，居人類惡性腫瘤死亡率第二[4]。胰腺癌的致死數與發病人數都呈上升趨勢，是兩性癌癥死亡的第七大原因素。因此，識別生物標志物對早期診斷和基因靶向治療的發展至關重要。

SMAD4基因位于18號染色體上，由12個外顯子構成，編碼552個氨基酸序列。在大約30%的胰腺癌中，SMAD4純合缺失。同時，SMAD4在胰腺導管腺癌中，約55%-60%表現出SMAD4的突變失活。核苷類似物吉西他濱通過將脫氧胞苷的20個碳原子替換為氟原子來抑制DNA復制。由于化療耐藥性的產生，它對人胰腺癌細胞的細胞毒性是有限的。GEM誘導的細胞凋亡與癌細胞中的DNA損傷有關，抑制或修復GEM誘導的DNA損傷可以顯著減少癌細胞的凋亡[5]。在這項研究中，我們首先檢測吉西他濱對細胞的敏感性，篩選出吉西他濱作用胰腺癌細胞的最佳作用濃度和時間。通過靶向siRNA敲除SMAD4，能夠顯著增強胰腺癌的惡性腫瘤進展，從而提高細胞遷移侵襲能力，并明顯抑制了GEM對胰腺癌細胞的殺傷作用。

參考文獻：

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Salewski I，Henne J，Engster L，et al.Combined Gemcitabine and Immune-Checkpoint Inhibition Conquers Anti-PD-L1 Resistance in Low-Immunogenic Mismatch Repair-Deficient Tumors[J].Mol Sci.2021 Jun 1;22（11）：5990.

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