LbCas12a蛋白的原核表達及活性檢測

劉 茹，李小龍,張曉倩，田小歡，余 梅,3，趙書紅,3，曹建華,3

(1.華中農業大學，農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.華中農業大學，農業農村部豬遺傳育種重點實驗室，武漢 430070；3.華中農業大學，生豬健康養殖協同創新中心，武漢 430070)

Cas12a(原名Cpf1)蛋白是CRISPR效應蛋白，該家族已被鑒定出46個種屬，在基因編輯領域應用較廣泛的有3種，分別是毛螺旋菌屬(Lachnospiraceae)LbCas12a、氨基酸球菌屬(Acidaminococcussp.)AsCas12a和新兇手弗朗西絲氏菌屬(Francisellanovicida)FnCas12a[1]，這3種蛋白顯示出類似的結構域特征，其氨基酸數目從1 228到1 307個不等[2-3]。Cas12a識別富含T的原型間隔子鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，由CRISPR RNA(crRNA)引導切割靶標雙鏈DNA(dsDNA)[4]。與Cas9蛋白相比，Cas12a具有相似的基因編輯效率，但脫靶效應更低，更具潛在的臨床應用價值[5-7]。

豬細小病毒(Porcine parvovirus, PPV) 是一種單鏈線性DNA病毒，屬于細小病毒科，它是引起繁殖障礙最常見的感染源之一[8]。PPV給養豬業造成了很大的損失，因此，需要一種有效檢測PPV感染的方法。目前常用的檢測PPV的技術是常規PCR和實時熒光定量PCR，這些技術在養豬場大規模推廣使用存在困難[9]。理想診斷方式的特點是廉價、準確，可以快速提供結果，并且能夠對多種樣本類型同時檢測[10]，因此亟需經濟高效的核酸檢測工具。LbCas12a被證實當其以序列特異性的方式切割雙鏈DNA(dsDNA)時，會引起非特異性單DNA(ssDNA)的反式切割[11],這為檢測ssDNA病毒提供了一種新思路。由于LbCas12a具有DNase和RNase活性，所以LbCas12a只需要1個單獨的crRNA(CRISPR-derived RNA)即可完成激活，pre-crRNA形成假結，可被LbCas12a識別和剪切[1,12]。反式切割活性需要LbCas12a/crRNA/靶DNA三元配合物的形成，通過Ruv C核酸酶結構域切割任意靠近的ssDNA[13]。Li等[13]對包含LbCas12a在內的9個種屬的Cas12a蛋白進行測試，發現所有蛋白均在質粒dsDNA上表現出了內切酶活性，并且在ssDNA上均具有順式和反式切割活性，這表明順式和反式切割ssDNA的活性可能普遍存在于Cas12a蛋白中。CRISPR-LbCas12a系統在分子檢測領域中具有較大的應用潛力，是目前LbCas12a蛋白的應用熱點之一[14]。利用該蛋白的反式切割特性，配合標記熒光的單鏈核酸探針，從而實現病原核酸的高靈敏檢測。此類研究結果在新冠病毒、非洲豬瘟等病原檢測中已取得成功[9,11,15]。本研究通過原核表達系統，利用硫代半乳糖苷IPTG對重組菌進行誘導表達并利用Ni-NTA樹脂進行親和層析純化，得到高濃度LbCas12a蛋白，并進行了功能活性檢測，結果可為進一步利用LbCas12a蛋白進行病原檢測提供了研究基礎和可行方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株 pMBP-LbCas12a質粒購自北京中源合聚生物科技有限公司；pET-28a(+)質粒和大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞均購自翌圣生物科技(上海)有限公司；PUC57質粒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自上海唯地生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 Gloria Nova HS DNA聚合酶、ABclonal MultiF Seamless Assembly Mix均購自ABclonal公司；DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；去內毒素質粒提取試劑盒購自Omega公司；NheⅠ、SalⅠ、NEBuffer2.1均購自NEB公司；IPTG購自Biofroxx公司；Ni-NTA Beads 6FF購自SMART公司；超濾管購自Millipore公司；Agencourt AMPure XP Beads購自Beckman Coulter公司；T7 High Yield RNA Transcription kit購自Vazyme公司；Qubit 4.0購自Invitrogen公司；超聲波細胞破碎儀購自Sonics公司。

1.2 引物設計與目的基因擴增

參照pMBP-LbCas12a質粒(Addgene，113431)中LbCas12a基因的序列，利用SnapGene 3.2.1軟件設計擴增LbCas12a基因的引物，并引入同源臂序列(表1)；參照pET-28a(+)質粒序列，設計反向PCR擴增線性化載體的引物；參照GenBank公布的PPV序列(登錄號：NC_001718.1)，利用SnapGene軟件設計引物PPV-1和T7-PPV。 引物信息見表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司武漢分公司合成。 用Gloria Nova HS DNA聚合酶進行目的基因擴增。 PCR擴增體系為25 μL：Gloria Nova HS 2×HF Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，質粒模板1 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性45 s；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環;72 ℃延伸5 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶。

表1 引物信息

1.3 重組質粒pET28a-LbCas12a的構建

利用SnapGene 3.2.1軟件構建pET28a-LbCas12a重組質粒圖譜。 將線性化載體pET-28a(+)與目的基因LbCas12a按摩爾比1∶3進行無縫克隆，反應體系20 μL：2×MultiF Seamless Assembly Mix 10 μL，DNA 6 μL，ddH2O補至20 μL。反應條件：50 ℃ 15 min。取5 μL組裝產物轉化至50 μL大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布至含有卡納抗性(K+)的LB平板，挑取單菌落于LB(K+)液體培養基中培養，37 ℃培養6 h后送北京擎科生物科技有限公司武漢分公司測序。測序正確的菌液進行重組質粒pET28a-LbCas12a的提取，并利用NheⅠ和SalⅠ進行雙酶切，并采用NheⅠ和SalⅠ分別進行單酶切作為陰性對照，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 IPTG誘導條件優化

1.4.1 誘導濃度 將重組質粒pET28a-LbCas12a轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，涂布含有卡納抗性的LB平板中，37 ℃過夜培養，次日挑取單菌落于LB(K+)液體培養基中培養，按1∶100的比例轉接至5份10 mL新鮮LB培養基中，37 ℃、220 r/min培養至菌液D600 nm值在0.6～0.8之間，依次加入終濃度為0.5、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min誘導4 h，將蛋白樣進行12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

1.4.2 誘導溫度 采用與1.4.1相同的方式進行菌體培養，選取37和30 ℃ 2個溫度分別進行誘導，4 h后收集蛋白進行12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

1.5 重組蛋白表達形式鑒定

在最佳濃度和最佳溫度條件下，各取10 mL誘導后的菌液，8 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS清洗2次，用1 mL裂解液重懸，加入終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF，于冰上進行超聲裂解，超聲功率為35%，超聲裂解4 s，靜置6 s，多次循環至溶液基本澄清。4 ℃、14 000 r/min離心10 min，用1 mL PBS重懸沉淀，各取50 μL蛋白樣進行12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

1.6 重組蛋白純化與濃縮

收集誘導后的蛋白上清液，用Ni-NTA樹脂進行純化，4 ℃結合4 h后用含不同濃度咪唑(50、150、250、500 mmol/L)的洗脫液進行梯度洗脫，收集純化后的蛋白于-20 ℃保存。 采用截流量為50 ku的超濾管進行濃縮，將濃縮前后的樣品進行12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測，試驗重復3次，采用ImageJ 1.8.0軟件對電泳條帶進行灰度值分析。濃縮后的樣品加入等體積的50%甘油，利用BCA法對蛋白進行定量。

1.7 LbCas12a蛋白活性驗證

1.7.1 靶標DNA與crRNA的設計 在NCBI上下載PPV的DNA序列，選取待檢測的靶標位點克隆到PUC57質粒上，用PPV-1特異性引物對重組質粒進行擴增。根據PPV DNA的特征，設計長度為50 bp的crRNA，利用T7-PPV引物擴增質粒，合成帶T7聚合酶啟動子序列的DNA片段，再利用T7轉錄酶進行體外轉錄，反應體系為20 μL：10×Reaction Buffer 2 μL，ATP Solution 2 μL，GTP Solution 2 μL，UTP Solution 2 μL，CTP Solution 2 μL，DNA Template 1 μg，T7 RNA Polymerase Mix 2 μL，RNase-free H2O補至20 μL。反應條件為：37 ℃ 2 h。經Ampure XP Beads純化后，通過Qubit 4.0精確定量。將crRNA產物在70 ℃水浴2 min，立即放入冰上進行驟冷，產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7.2 ssDNA報告探針設計 ssDNA報告探針FQ結構為：5′-端修飾有6-FAM基團，3′-端修飾有BHQ-1淬滅基團，序列為：5′-TTATT-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.7.3 LbCas12a蛋白體外活性檢測 為了驗證濃縮后的LbCas12a蛋白是否具有反式切割ssDNA的活性，將PPV作為靶標位點進行檢測。試驗設置1個無LbCas12a蛋白的對照組、4個不同蛋白濃度梯度(125、250、500、1 000 nmol/L)的試驗組，每組各3個重復。 在上述不同濃度的蛋白樣品(15.5 μL)中加入2.5 μL 0.5 μmol/L crRNA，2 μL NEBuffer 2.1，37 ℃孵育1 h后形成蛋白RNA復合物(RNP)。加入5 μL ssDNA報告探針FQ和0.5 ng PPV DNA，37 ℃孵育0.5 h。將反應后的樣品轉移至酶標板，在激發光波長495 nm、發射波波長520 nm條件下檢測探針熒光強度。

1.8 數據統計及分析

GraphPad Prism 8.0軟件進行t檢驗，結果以平均值±標準誤表示。P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 LbCas12a基因和pET-28a(+)線性化載體擴增結果

以pMBP-LbCas12a質粒為模板擴增LbCas12a基因，擴增得到1條大約為3 733 bp的單一片段，以pET-28a(+)質粒為模板擴增線性化載體，擴增得到1條大約為5 323 bp的單一片段(圖1)，與預期大小一致。

2.2 pET28a-LbCas12a重組質粒鑒定結果

重組質粒圖譜如圖2A所示，同源重組后pET28a-LbCas12a質粒全長9 007 bp。重組質粒在NheⅠ或SalⅠ單酶切條件下均為單帶，且大小約為9 007 bp，與預期大小基本一致；重組質粒在NheⅠ和SalⅠ雙酶切后，可得到1條約5 323 bp的pET-28a(+)載體條帶和約3 733 bpLbCas12a基因條帶(圖2B)，與預期目的片段大小基本一致，證明重組質粒構建成功。

2.3 重組蛋白表達條件優化及表達形式鑒定

重組蛋白表達條件的優化結果如圖3所示。未誘導菌樣本總蛋白未見與目標蛋白相對分子質量大小一致的條帶，加入IPTG誘導后，均在143 ku左右處出現清晰條帶(圖3A)，與預期蛋白大小相符，因此，選取最低濃度0.5 mmol/L作為最佳濃度，以期降低IPTG對細胞的損傷。誘導溫度在37 ℃時目的蛋白的表達量明顯高于30 ℃(圖3B)，由此可知最佳誘導溫度為37 ℃。在重組菌的上清和沉淀中均觀察到143 ku左右的蛋白條帶，但是上清中的蛋白表達量高于沉淀中的(圖3C)，表明重組蛋白的表達形式主要為可溶性表達。

1,pET-28a(+)擴增產物；2、3，LbCas12a擴增產物；M，DL10000 DNA Marker1,Amplified product of pET-28a(+);2 and 3,Amplified product of LbCas12a;M,DL10000 DNA Marker圖1 LbCas12a基因和pET-28a(+)線性化載體的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of LbCas12a gene and pET-28a(+) linearized carrier

①A，重組質粒示意圖；B，重組質粒鑒定。②M，DL10000 DNA Marker；1，NheⅠ、SalⅠ雙酶切重組質粒；2，NheⅠ單酶切重組質粒；3，SalⅠ單酶切重組質粒①A,Schematic diagram of recombinant plasmid;B,Identification of recombinant plasmid.②M,DL10000 DNA Marker;1,Recombination plasmid by double enzyme digestion;2,Recombination plasmid by NheⅠ digestion;3,Recombination plasmid by SalⅠ digestion圖2 pET28a-LbCas12a重組質粒圖譜和雙酶切鑒定Fig.2 Recombinant plasmid pET28a-LbCas12a map and identification by double digestion

①A，不同濃度IPTG誘導LbCas12a蛋白表達；B，不同溫度誘導LbCas12a蛋白表達；C，LbCas12a蛋白表達形式鑒定。②M，Protein Marker；1、6，未誘導菌體；2～5，IPTG誘導濃度分別為0.5、0.6、0.8、1.0 mmol/L；7、8，誘導溫度分別為37、30 ℃；9、10，菌液超聲破碎后的上清和沉淀①A,LbCas12a protein expression was induced by different concentrations of IPTG;B,LbCas12a protein expression was induced by different temperatures;C,LbCas12a protein expression type identification.②M,Protein Marker;1 and 6,Non induced bacteria;2-5,IPTG induced concentrations were 0.5,0.6,0.8,1.0 mmol/L,respectively;7 and 8,Induction temperature is 37 and 30 ℃;9 and 10,Supernatant and precipitation after ultrasonic crushing of E.coli圖3 LbCas12a蛋白表達條件及表達形式的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of LbCas12a protein expression condition and expression form

2.4 重組蛋白純化與濃縮結果

由圖4可知，250 mmol/L咪唑洗脫的重組蛋白在143 ku處條帶最清晰(圖4A)；灰度值定量分析表明，洗脫液中咪唑濃度為150、250、500 mmol/L時目的蛋白的灰度值均極顯著高于50 mmol/L的灰度值(P<0.01)，且250 mmol/L的灰度值最高(圖4B)，因此250 mmol/L為最佳咪唑洗脫液的濃度；濃縮后，蛋白濃度明顯提升，且蛋白大小為143 ku(圖4A)，與預期一致，灰度值定量分析發現，濃縮后的蛋白量極顯著高于純化蛋白(P<0.01)(圖4C)。BCA法測定結果表明，重組蛋白的濃度為485 ng/μL。

①A，LbCas12a蛋白純化條件與濃縮LbCas12a蛋白SDS-PAGE檢測；B、C，灰度值分析。②M,蛋白質分子質量標準；1,粗蛋白樣；2～6，LbCas12a純化洗脫液中咪唑濃度依次為50、150、250、500、250 mmol/L；7，濃縮后的LbCas12a蛋白。③與50 nmol/L組或純化蛋白相比，**，差異極顯著(P<0.01)①A,SDS-PAGE detection of LbCas12a protein purification conditions and concentrated LbCas12a protein; B and C, Gray value analysis;②M,Protein Marker;1,Crude protein;2-6,The concentration of imidazole in LbCas12a purified eluent was 50,150,250,500,250 mmol/L,respectively;7,LbCas12a protein after concentration.③Compared with 50 nmol/L group/purification protein,**,Extremely significant difference (P<0.01)圖4 LbCas12a蛋白純化與濃縮結果SDS-PAGE和灰度值分析Fig.4 SDS-PAGE and gray scanning analysis of purification and concentration of LbCas12a protein

2.5 LbCas12a蛋白活性檢測結果

2.5.1 crRNA和靶標DNA的擴增結果 靶標PPV的擴增產物如圖5A所示，帶有T7聚合酶啟動子序列的轉錄模板的擴增產物如圖5B所示，兩者均在目標大小197、270 bp處顯示單一條帶，且無雜帶。crRNA大小約為50 bp，經1.0%瓊脂糖電泳檢測，目的條帶大小約50 bp(圖5C)，說明crRNA轉錄成功。

A～C，分別為靶標PPV dsDNA、帶T7聚合酶啟動子序列的轉錄模板和crRNA鑒定A-C,Identification of target PPV dsDNA,transcription template with T7 polymerase promoter sequence and crRNA圖5 靶標PPV dsDNA、轉錄模板和crRNA的瓊脂糖凝膠分析Fig.5 Agarose gel analysis of target PPV dsDNA,transcription template and crRNA

2.5.2 LbCas12a蛋白體外活性檢測結果 活性檢測示意圖如圖6A所示，黑色圓圈代表淬滅基團BHQ-1，五角星形狀代表熒光基團6-FAM，在LbCas12a/crRNA/dsDNA三元復合物存在的情況下，ssDNA探針FQ可以被切開，熒光基團與淬滅基團分離，產生熒光差。由圖6B可知，125、250、500、1 000 nmol/L LbCas12a蛋白組熒光值均極顯著高于對照組(P<0.01)，說明ssDNA探針FQ中熒光基團被成功釋放，純化后的LbCas12a具有活性。

①A，LbCas12a反式切割活性示意圖；B，LbCas12a切割活性檢測。②與空白對照組(0 mmol/L LbCas12a)相比，**，差異極顯著(P<0.01)①A,Schematic diagram of LbCas12a trans cutting activity;B,LbCas12a cutting activity detection.②Compared with control group (0 mmol/L LbCas12a),**,Extremely significant difference (P<0.01)圖6 LbCas12a蛋白的反式切割活性分析Fig.6 Trans-activity analysis of LbCas12a protein

3 討 論

近年來，隨著新冠病毒SARS-Cov-2、PPV、非洲豬瘟等病毒的流行，人們迫切需要開發快速、簡便、準確的病原鑒定技術。臨床即時檢驗(point-of-care testing,POCT)技術應運而生，其核心組成成分是Cas12a蛋白家族。本研究將LbCas12a基因克隆至pET-28a(+)載體上，利用原核表達系統進行誘導表達，得到純度較高、活性較強的LbCas12a蛋白，為后續基于LbCas12a蛋白的POCT應用提供了生物材料。

本研究中重組蛋白LbCas12a的大腸桿菌原核表達體系，具有操作簡單、成本低廉、蛋白表達量高等優點[16]。在原核表達體系中，通常采用pET和pGEX表達載體[17]，前者所含標簽為多組氨酸(6×His)，后者為谷胱甘肽轉移酶(GST)。與GST-tag比較，His-tag約0.64 ku，其很少干擾目標蛋白的功能、活性和結構，且免疫原性較低[18-20]。大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞缺乏Lon和OmpT蛋白酶，與T7 LacO啟動子具有很高的親和性[16]，能夠有效避免重組蛋白降解，在本研究中pET載體中的LbCas12a蛋白充分被誘導表達。

將重組質粒pET28a-LbCas12a轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，利用IPTG誘導蛋白表達，有研究認為，不同濃度的IPTG可能影響最終蛋白的產量[21]，但本研究中不同濃度IPTG對重組蛋白的表達效率影響不顯著，說明IPTG濃度不是影響重組蛋白的表達效率的唯一因素，與黃孔威等[22]的結果基本一致。本研究進一步對誘導溫度進行了優化，發現37 ℃時目的蛋白表達量高于30 ℃，可能原因是在30 ℃條件下，細菌生長速度變慢，重組蛋白的表達效率降低所致[23]。最后基于多組氨酸對鎳離子(Ni2+)的螯合親和力，本研究采用Ni-NTA樹脂親和層析柱方法進行純化，用超濾方式濃縮，濃縮效果較好，為深入研究LbCas12a蛋白的功能提供條件。

多項研究表明，Cas12a的反式切割活性可以應用在核酸POCT檢測中[11,24-27]。如果反應體系中存在靶標DNA如病毒核酸，LbCas12a/crRNA復合物靶向目標DNA形成三元復合物，從而激活LbCas12a的反式切割活性，將體系中與ssDNA偶聯的熒光分子切下，釋放熒光信號[28-29]。利用本研究中的LbCas12a蛋白對PPV進行檢測，設計5′-端修飾熒光基團FAM和3′-端修飾淬滅基團BHQ的ssDNA熒光報告探針，當存在PPV核酸時，LbCas12a發揮作用，探針被切割，熒光基團與淬滅基團分離，檢測到了釋放的熒光信號，且在低濃度LbCas12a(125 nmol/L)的試驗組熒光強度也顯著高于對照組，與彭小喚[30]的結果相似，表明本研究純化濃縮得到的LbCas12a蛋白具有生物活性，為畜牧業生產中POCT應用提供了重要的生物學工具。

4 結 論

本研究成功構建pET28a-LbCas12a重組質粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中進行原核表達，確定了IPTG最佳誘導濃度為0.5 mmol/L、最佳誘導溫度為37 ℃，且主要為可溶性表達。經分離純化、超濾濃縮后得到分子量為143 ku的LbCas12a蛋白，濃度為485 ng/μL，具有反式切割活性。結果可為后續基于CRISPR/LbCas12a系統的POCT檢測技術在畜牧業中的應用奠定了基礎。