策勒黑羊ERα基因克隆、生物信息學分析及卵巢組織表達研究

張繼虎，米熱妮薩，王子渲，李 琳，邢 鳳，劉書東

(1.塔里木大學動物科學與技術學院，阿拉爾 843300；2.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300；3.青島農業大學動物科技學院，青島 266109)

雌激素是動物體內最重要的激素之一，對完善動物生殖系統的結構和功能是不可或缺的。雌激素通常指內源性雌激素化合物17β-雌二醇(E2)、雌酮和雌三醇，其中E2活性最強[1]，其廣泛的生物作用是通過與其受體結合實現的，這幾種物質都可與由雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)基因編碼的雌激素受體α(estrogen receptor α,ERα)結合[2-4]。ERα是核受體家族的成員[5-6]，對促進動物卵泡發育和提高繁殖力具有重要作用[7-9]。促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)通過脈沖式的方式從下丘腦分泌到垂體前葉，并與垂體促性腺激素細胞上的受體結合，從而促進促卵泡素(follicle stimulating hormone，FSH)和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的合成與分泌[10]。FSH和LH通過血液循環到達卵巢促進卵巢發育，并促使卵巢合成雌激素[11]。雌激素與卵巢ERα特異性結合后，能夠刺激卵巢顆粒細胞的增殖，增強顆粒細胞促性腺激素受體的水平和顆粒細胞對促性腺激素的應答[12]。研究表明，ERα基因發生突變后可導致卵巢早衰喪失生育功能[13]；小鼠ERα基因缺失后可導致LH分泌和發情周期紊亂[14]。策勒黑羊是新疆地區典型的代表品種，具有性成熟早、常年發情等特點，目前，國內外少有對策勒黑羊ERα基因原核表達及卵巢不同時期表達等研究報道。鑒于此，本研究對策勒黑羊ERα基因進行克隆及生物信息學分析，并對卵泡期、黃體期和妊娠30 d時卵巢中ERα基因表達量進行檢測，以期為研究ERα基因的功能及其對綿羊發情、妊娠等過程的影響提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于新疆阿克蘇市某屠宰場，選取處于卵泡期、黃體期和妊娠30 d的策勒黑羊各3只，取適量上述時期策勒黑羊的卵巢，用無菌手術剪剪碎后放入凍存管中，迅速置于液氮中保存，后轉入-80 ℃保存備用。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T克隆載體購自TaKaRa公司；反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞均購自北京全式金生物技術有限公司；藍白斑試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 RNA提取及cDNA合成

取出卵巢組織，利用Transzol法提取RNA，提取后的RNA利用核酸蛋白檢測儀檢測濃度。檢測合格后，統一濃度進行反轉錄合成cDNA。反應體系：5×gDNA Eraser 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA 2 μL，RNase-free ddH2O 5 μL,反應條件為42 ℃ 2 min；RNase-free ddH2O 4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix 1 μL，RT Prime Mix 1 μL，5×Prime Script Buffer 4 μL，反應條件為42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.4 引物設計及合成

從GenBank中查詢綿羊ERα基因序列(登錄號：XM_042253635.1)，用Primer Premier 6.0軟件設計ERα基因克隆和實時熒光定量PCR引物，引物信息見表1。其中，引物ERα-1擴增編碼區的1-805 bp，ERα-2擴增777-1 401 bp，ERα-3擴增1 284-1 791 bp。以β-actin(登錄號：NM_001009784.3)為內參基因。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 PCR擴增及克隆

PCR反應體系25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。其中，ERα-1為60 ℃(每個循環降0.5 ℃)，ERα-2和ERα-3退火溫度為58 ℃。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，膠回收純化目的片段并與pMD19-T克隆載體連接，16 ℃反應30 min；取5 μL連接產物與100 μL大腸桿菌DH5α感受態細胞混合，冰浴30 min后，42 ℃條件下熱激90 s，快速轉入離心管中冰浴；加入400 μL不含氨芐青霉素的培養基，于37 ℃、225 r/min搖床復蘇90 min。待溶液變渾濁后，4 000 r/min離心5 min，棄掉適量上清液，將剩余菌液均勻地鋪在含有氨芐青霉素的培養基上，放置30 min；將培養皿倒置，37 ℃恒溫培養箱過夜。合格菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.6 相似性比對、系統進化樹構建及生物信息學分析

通過DNAMAN對策勒黑羊ERα基因與山羊(登錄號：XP_042109569.1)、牛(登錄號：NP_001001443.1)、豬(登錄號：XP_020938716.1)、人(登錄號：NP_000116.2)、犬(登錄號：XP_038509304.1)和小鼠(登錄號：NP_001289460.1)進行氨基酸序列相似性比對，并構建系統進化樹。利用表2中的在線軟件對策勒黑羊ERα氨基酸序列進行生物信息學分析。

1.7 實時熒光定量PCR擴增

以策勒黑羊cDNA為模板，利用實時熒光定量PCR檢測卵泡期、黃體期和妊娠30 d時策勒黑羊卵巢中ERα基因表達量。PCR反應體系15 μL：2×Transtant qPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL,ddH2O 5.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸20 s，共40個循環。

1.8 統計分析

采用2-ΔΔCt法計算策勒黑羊卵泡期、黃體期和妊娠30 d時卵巢中ERα基因的相對表達量。使用SPSS 24.0統計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，數據以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 策勒黑羊ERα基因克隆

策勒黑羊ERα基因PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后顯示片段長度分別為811、624和791 bp(圖1)，與預期片段大小相符。將得到的序列通過BLAST比對發現，與綿羊ERα基因序列相似性為99.78%。在第242、681、862和1 238 bp處發生替換，分別是G→A、G→A(同義突變)、G→C和G→T，相應第81、288和413位氨基酸變化為G→D、R→T、R→S。

綿羊ERα氨基酸序列劃分為6個功能區(圖2)，分別是A/B(1-182)、C(183-258)、D(259-328)、E(329-525)和F(526-596)區域，在A/B和E域含分別含有AF-1(activation function 1)和AF-2(activation function 2)區域。策勒黑羊ERα氨基酸突變分別在發生A/B、D和E區域。

2.2 相似性比對及系統進化樹構建

由圖3可知，策勒黑羊ERα氨基酸序列與山羊、牛、豬、人、犬和小鼠的相似性較高，分別為99.0%、97.8%、92.4%、92.1%、91.2%和89.1%。由圖4可知，策勒黑羊與山羊、牛的親緣關系較近，與豬、人和犬的親緣關系次之，與小鼠的親緣關系最遠。

M，DL2000 DNA Marker；1，ERα-1基因PCR擴增產物；2～4，ERα-2基因PCR擴增產物；5～7，ERα-3基因PCR擴增產物M，DL2000 DNA Marker；1，PCR amplification product of ERα-1 gene；2-4，PCR amplification products of ERα-3 gene；5-7，PCR amplification products of ERα-3 gene圖1 策勒黑羊ERα基因PCR擴增產物檢測Fig.1 Detection of PCR amplification products of ERα gene in Cele Black sheep

圖2 ERα氨基酸序列功能劃分Fig.2 Function division of ERα amino acid sequences

圖3 ERα氨基酸相似性比對Fig.3 Amino acid similarity alignment of ERα protein

圖4 不同物種ERα系統進化樹構建Fig.4 Phylogenetic tree construction of ERαin different species

2.3 生物信息學分析

2.3.1 理化性質及親/疏水性 利用ExPASy軟件預測策勒黑羊ERα蛋白的理化性質及親/疏水性，結果顯示，策勒黑羊ERα蛋白分子式為C2930H4600N822O862S41，理論等電點(pI)為7.32，存在60個帶負電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸+谷氨酸)和60個帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸+賴氨酸)，不穩定指數為50.33，屬于不穩定蛋白；ERα氨基酸序列第271位谷氨酰胺(Gln)親水性指數最小，為-3.433，位于389位的蛋氨酸(Met)親水性指數最大，為2.511，親水性總平均值為-0.355，表明該多肽屬于親水蛋白(圖5)。

2.3.2 糖基化位點和磷酸化位點 使用NetOGlyc 4.0預測策勒黑羊ERα蛋白的O-糖基化位點，結果顯示存在28個O-糖基化位點；利用NetNGlyc 1.0預測N-糖基化位點，結果顯示不存在N-糖基化位點；利用NetPhos 3.1預測磷酸化位點，結果顯示存在54個磷酸化位點(圖6)。

2.3.3 亞細胞定位 利用PSORTⅡ預測ERα蛋白在細胞中的定位發現，ERα主要定位于細胞核中，占比為73.9%；線粒體中占8.7%，細胞質、內質網、囊泡和質膜中各占4.3%。

2.3.4 二級結構和三級結構 通過SOPMA軟件預測策勒黑羊ERα蛋白二級結構，主要由α-螺旋和無規則卷曲組成，分別為39.43%和43.79%，其余結構為延伸鏈和β-轉角，分別為11.41%和5.37%(圖7)。利用SWISS-MODEL在線軟件預測策勒黑羊ERα蛋白三級結構，仍以α-螺旋和無規則卷曲為主(圖8)。

2.4 策勒黑羊卵泡期、黃體期及妊娠30 d時卵巢中ERα基因表達水平

以β-actin為內參基因，通過實時熒光定量PCR檢測ERα基因在策勒黑羊卵泡期、黃體期和妊娠30 d卵巢中的表達情況，結果見圖9。由圖9可知，與卵泡期相比，ERα基因在黃體期表達量極顯著下降(P<0.01)，妊娠30 d時卵巢中的表達量極顯著上升(P<0.01)。

圖5 策勒黑羊ERα蛋白質親/疏水性預測Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of ERα protein in Cele Black sheep

圖6 策勒黑羊ERα蛋白磷酸化位點預測Fig.6 Phosphorylation sites prediction of ERα protein in Cele Black sheep

線條從長到短依次為α-螺旋、延伸鏈、β-轉角及無規則卷曲The order of lines from long to short are alpha helix,extended chain,beta turn and random coil圖7 策勒黑羊ERα蛋白二級結構預測Fig.7 Secondary structure prediction of ERα protein in Cele Black sheep

圖8 策勒黑羊ERα蛋白三級結構預測Fig.8 Tertiary structure prediction of ERα protein in Cele Black sheep

肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖9 策勒黑羊卵泡期、黃體期及妊娠30 d卵巢中ERα基因表達量Fig.9 Expression of ERα gene in ovary of Cele Black sheep at follicular phase,luteal phase and 30 days of pregnancy

3 討 論

本研究克隆獲得策勒黑羊ERα基因CDS序列，全長1 791 bp，編碼596個氨基酸。策勒黑羊ERα氨基酸序列與山羊、牛的相似性較高，分別為99.0%和97.8%，與小鼠的相似性為89.1%，表明該基因在進化上有較高的保守性。ERα定位在細胞內，且細胞核中占比最多，屬于核受體家族成員，為親水蛋白，不存在跨膜結構，這與其屬于核受體家族成員相符合。ERα蛋白具有54個磷酸化位點，可能成為蛋白激酶和磷酸酶的修飾位點，在細胞調節通路過程中發揮著重要作用。

目前已證明ERα可分為6個功能區：A/B、C、D、E、F區域[15]。A/B域包含1個非配體依賴型轉錄激活功能區AF-1區，能與相關轉錄因子相互作用激活靶基因[16]；C域包含有2個鋅指結構，并富含高度保守的堿性氨基酸殘基，主要參與DNA的結合[17]；D區域為絞鏈區，在無雌激素的條件下，該區可結合1個熱應激蛋白并進行適當的折疊以保護疏水的配體結合區，從而維持受體的非活性狀態[18]，這一不保守的無規則區域在A/B和C域具有分子變構的作用，能夠對生物環境的變化做出反應；E區域含有1個在激素依賴的轉錄過程中有重要作用的AF-2區，在轉錄激活中起調節作用[19]；F區域為碳端結合域。雌激素受體是所有性類固醇激素受體中唯一存在該區域的受體，目前對這一區域功能了解甚少。

本研究結果表明，ERα基因在策勒黑羊不同時期卵巢組織中均有表達，表明其在生殖系統中發揮作用。雌激素主要來源于卵泡內膜細胞和卵巢顆粒細胞，與ERα結合后可以與神經和內分泌系統調節動物的排卵周期。雌激素在卵巢卵泡發育的過程中逐漸積累，卵泡期時呈現逐漸上升的趨勢，在排卵之前達到最高峰，排卵后急劇降低。Juengel等[20]在綿羊卵巢顆粒細胞中發現ERα基因有表達，且三級卵泡和成熟卵泡中表達量偏高。如果排出的卵子未受精，黃體維持一段時間后在前列腺素(PGF2α)作用下退化。處于卵泡期的策勒黑羊卵巢受到外周血液中高水平雌激素的影響，ERα基因表達量極顯著高于黃體期。包瑩瑩等[21]在甘加藏羊(綿羊)卵巢中發現，發情期和發情前期ERα基因相對表達量高于發情后期和間情期，且間情期其蛋白表達量相對較低。如果排出的卵子已受精，PGF2α則會受到抑制，維持黃體功能并成為妊娠黃體。妊娠后卵泡不再發育，雌激素的分泌量減少，但黃體和胎盤可以分泌雌激素，所以仍可以檢測到雌激素。在綿羊妊娠14～33 d時，黃體細胞經過未成熟和成熟2個階段。18～28 d時成熟黃體期細胞數量增多、體積變大，未成熟黃體細胞較少，這2種細胞占據全部黃體細胞的83%[22]，在妊娠90 d左右時，雌激素含量達到最高。策勒黑羊妊娠30 d時卵巢中ERα基因高表達，暗示其在妊娠過程中發揮著重要作用。Berisha等[23]觀察到牛妊娠90 d時卵巢中ERα基因表達量較少，推測可能是不同物種不同妊娠時間存在差異。ERα基因在策勒黑羊卵巢卵泡期、黃體期和妊娠30 d時均有表達且有顯著變化，表明ERα基因在卵泡生長、黃體形成和妊娠的調節中起著重要作用，但其具體機制仍有待進一步研究。

4 結 論

本研究克隆獲得策勒黑羊ERα基因序列，全長1 791 bp，編碼596個氨基酸，與山羊和牛的相似性較高。ERα為親水蛋白，定位在細胞內，不存在跨膜結構，二級結構以α-螺旋和無規卷曲為主。ERα基因在策勒黑羊卵泡期、黃體期和妊娠30 d的卵巢中均有表達，卵泡期和妊娠30 d時高表達，黃體期時表達量最低，表明ERα基因在策勒黑羊生殖過程中發揮重要作用。