噬菌體展示系統的構建及其在疾病防控領域應用研究進展

侯 偉

(山東省菏澤市農業技術推廣中心，菏澤 274000)

抗體庫技術是近30年來抗體工程領域的一大進展，目前應用最多的展示抗體庫技術為噬菌體展示技術。因噬菌體展示技術易于在體外制備抗體，現已成為生命科學中研發抗體類藥物的強大平臺。從1980年開始，噬菌體展示技術作為分子生物學技術的研究和發展成果應運而生[1-2]。噬菌體-抗體復合物將基因型與表現型結合于一體，通過將選擇能力與擴增能力結合，擴大篩選容量。 1985年,Smith[3]通過絲狀噬菌體將人工擴增的外源基因融合到病毒衣殼蛋白中,證明了絲狀噬菌體展示肽的能力，這使得外源蛋白和噬菌體外殼蛋白在噬菌體表面融合表達成為可能，使基因工程抗體技術進入了一個新的時代[4]。1990年，Mccafferty等[5]成功利用重構的噬菌粒載體及作為輔助噬菌體的絲狀噬菌體構建了噬菌體抗體文庫[6-7]，將單鏈抗體(single chain fragment variable,scFv)融合到噬菌體基因Ⅲ中，促進了通過將抗體展示在噬菌體表面從而可選擇、識別抗原的噬菌體展示技術的發展。噬菌體展示技術可允許各類抗體文庫(如天然抗體文庫、免疫抗體文庫[8]和合成抗體文庫[9]等)的構建，并有助于抗體藥物的發展。 2018年，Smith和Winter因對噬菌體展示技術發展的貢獻及巨大影響獲得了諾貝爾化學獎[10]。

噬菌體展示技術在識別與各種靶標特異性結合的目的蛋白方面已成為強有力的技術，噬菌體展示文庫的高通量篩選是通過生物淘選親和性進行的。抗體噬菌體展示技術(antibody phage display,APD)的主要原理是通過PCR擴增抗體的輕、重鏈可變區基因，通過噬菌體侵染的方法，將抗體的Fab片段或scFv融合表達在噬菌體的表面，構建初級噬菌體-抗體庫，再經過多輪“吸附-洗脫-擴增”過程，篩選并富集得到特異性抗體[11]。該技術允許在體外篩選任何特異性的scFv，具有高親和力和特異性的抗體藥物對于病毒性疾病和自身免疫疾病等疑難雜癥的治療是安全且有效的，這極大地促進了在科學研究及臨床診斷上抗體藥物的制備。

1 噬菌體抗體庫的分類

根據抗體的來源可將噬菌體抗體庫分為天然抗體庫和免疫抗體庫，以不經免疫的淋巴細胞構建的抗體庫稱為天然抗體庫，該抗體庫可用于篩選各類抗原[12]，且庫容量大，但親和力通常較低；以抗原免疫后個體的淋巴細胞構建的抗體庫稱為免疫抗體庫，該抗體庫的庫容量不需要很大，且試驗中易于從該類抗體庫中篩選到針對某一抗原的特異性抗體。考慮到免疫本身的單一性和偏向性，某一特定的免疫抗體庫只能產生針對其特定抗原的抗體，因此針對特定抗原的免疫抗體庫并不能作為一個廣泛應用的平臺。Xin等[13]研究表明，利用免疫后的動物制備的抗體文庫的特異性、抗體陽性率明顯高于天然抗體文庫。

抗體文庫，根據噬菌體的不同可分為M13、f1、fd絲狀噬菌體文庫，T4、T7噬菌體文庫，λ噬菌體文庫；根據載體不同可分為噬菌體文庫和噬菌粒文庫；根據來源不同可分為隨機肽文庫、cDNA文庫、抗體文庫和蛋白質文庫。現在較常用的絲狀噬菌體是單股DNA病毒，內有一個環狀單鏈DNA分子，含DNA復制和噬菌體增殖所需的遺傳信息[14]。因為噬菌體在吸附細菌時需要噬菌體外殼蛋白與F菌毛的末端結合，故M13噬菌體僅感染表達F菌毛(含F質粒，能產生性菌毛)的大腸桿菌陽性菌株[15]。

2 噬菌體抗體庫的構建

2.1 構建流程

噬菌體抗體庫的構建策略如圖1所示。可選擇將抗體的輕、重鏈先后連入噬菌粒中構建抗體庫，也可通過融合PCR方法用Linker將抗體輕、重鏈片段成功連接且在兩端添加酶切位點后再轉入噬菌粒中構建抗體庫。使用輔助噬菌體侵染重組菌，構建噬菌體-抗體庫。近幾年，噬菌粒在抗體庫構建和單鏈抗體篩選中的應用已越來越多[16]。通過將抗體的Fab片段與在琥珀突變抑制型菌株大腸桿菌XL1-Blue中的噬菌體外殼蛋白Ⅲ(pⅢ)的C-末端區域融合表達而形成融合蛋白，進而形成重組的噬菌粒pComb3XSS-Fab。Fab/pⅢ融合蛋白翻譯成重組蛋白后，由pelB Leader引導分泌到細菌胞周間質中，完成抗體的自然立體折疊，成為具有生物活性的scFv。噬菌粒pComb3XSS僅包含完整噬菌體F1的原始復制區，因此只能與輔助噬菌體VCSM13一起復制和包裝，以使其成為完整的噬菌體病毒。將重組外源基因的質粒pComb3XSS-Fab轉移到宿主菌中，通過輔助噬菌體VCSM13的拯救，形成帶有外源蛋白的重組噬菌體[17]。噬菌體中存在與抗體片段融合表達的外殼蛋白Ⅲ和天然外殼蛋白Ⅲ。融合表達的外殼蛋白是以融合表達形式表達的抗體，在重組噬菌體的組裝過程中，抗體Fab段通過與pⅢ蛋白融合表達而在噬菌體表面展示，這種融合表達蛋白可通過與相應抗原特異性結合而用于靶蛋白的篩選。天然外殼蛋白Ⅲ則為噬菌體的天然外殼蛋白Ⅲ，該噬菌體蛋白保留了感染宿主菌的特性，從而使重組噬菌體可進行增殖[18]。 噬菌粒pComb3XSS插入了氨芐青霉素抗性基因，輔助噬菌體VCSM13插入了卡那霉素抗性基因，因此可通過含有氨芐青霉素和卡那霉素抗性的抗生素培養板進行選擇性培養，只有重組噬菌粒pComb3XSS-Fab才可在此抗生素培養板上增殖[19]。一般需對抗體庫進行3～5輪的淘選，才能篩選得到與靶標親和性較強的重組蛋白，試驗過程中還可通過增加洗滌次數或去污劑的濃度來嚴格控制每輪淘選，以獲得親和性更佳的重組蛋白。

圖1 噬菌體抗體庫構建流程圖Fig.1 Flow chart of phage antibody library construction

2.2 噬菌體表達載體的選擇

噬菌體表達載體的選擇是噬菌體展示技術的關鍵，其對噬菌體表達系統的文庫容量和陽性率有較大影響[20]。近年來，試驗中用到較多的噬菌體表達載體有4種[21]。盡管是不同的表達載體，但其構建原理和結構基本相似，都是在噬菌體外殼蛋白Ⅲ基因前通過引入所需的限制性酶切位點以插入含有復制起始位點的目的基因，并同時在目的基因填充片段后引入標簽和抗性基因構建而成[22]。pComb3XSS作為最新的pComb載體，對pComb3的改進包括增加質粒穩定性和引入SfiⅠ酶切位點以用于克隆噬菌體展示的完整Fab、scFv、肽或其他蛋白質。可通過6×His標簽和HA標簽對scFv進行純化和檢測。最后引入琥珀終止密碼子以通過轉換為大腸桿菌的非抑制性菌株來關閉外殼蛋白Ⅲ融合蛋白的表達，從而允許產生可溶性蛋白。pComb3XSS結構示意圖見圖2。

圖2 噬菌體載體結構示意圖Fig.2 Schematic diagram of phage vector structure

2.3 噬菌體特異性侵染宿主菌株

由于M13噬菌體通過F質粒編碼的性纖毛進入宿主細胞內，故只能用雄性菌來增殖病毒。Messing[23]構建了多種攜帶F質粒并便于M13噬菌體進行基因操作的大腸桿菌菌株。噬菌體常規克隆使用的優良宿主菌株包括琥珀突變抑制型菌株大腸桿菌XL1-Blue和非琥珀突變抑制型菌株大腸桿菌HB215。大腸桿菌XL1-Blue因具有β-半乳糖苷酶，從而允許對重組質粒進行藍白斑篩選,且其具有四環素抗性，可用抗生素平板進行篩選。大腸桿菌XL1-Blue菌株基因型為recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F-proAB laclqZΔ M15 Tn10 (Tetr)]，其是內切核酸酶(endA)缺陷，極大地改善了miniprep DNA的質量，且重組(recA)缺陷可改善插入物穩定性[24]。大腸桿菌HB2151可使噬菌粒pComb3XSS中基因Ⅲ前的琥珀終止密碼子正常表達，即翻譯在TAG處終止，以關閉pⅢ融合蛋白的表達，從而允許產生含有HA-tag和His-tag標簽的可溶性Fab片段而不進行亞克隆。大腸桿菌因具有清晰的遺傳背景、較低的生產成本和較短的生產周期已成為原核表達系統中最常用的表達載體[25-27]。

2.4 輔助噬菌體的侵染特性

M13絲狀噬菌體僅感染F+的大腸桿菌，且感染宿主后在細菌內滾環復制，作為溫和噬菌體通常不裂解宿主細胞，而是通過分泌的方式從宿主細胞進入培養液中，此時宿主細胞能繼續生長和分裂，但與未感染細胞相比，其生長水平顯著降低。M13噬菌體基因組為單鏈DNA，核苷酸長為6 407 nt，編碼11種蛋白質，包含5種結構蛋白(pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ)和6種非結構蛋白[28]。其中，與噬菌體展示能力密切相關的蛋白為pⅢ和pⅧ(圖3)。pⅢ位于噬菌體的尾部，結合于宿主菌的F纖毛，由3個功能區組成。與pⅢ融合表達的多肽屬于低價拷貝[29]，而與pⅧ融合表達的多肽屬于高價拷貝，但這種方式展示的多肽較小。絲狀噬菌體展示系統一般是在pⅢ和pⅧ的N-端融合外源多肽[30-31]。目前所有已知的噬菌體都是在宿主細胞體內利用核糖體、蛋白質合成時所需的各種因子、各種氨基酸和能量產生系統來實現其自身的生長和繁殖，一旦離開宿主細胞，其既不能生長也不能復制。通過將噬菌體進行人工改造成為輔助噬菌體，其基因組具有M13噬菌體的所有功能基因，但IG區缺陷，不能被pⅡ蛋白識別，因而輔助噬菌體本身DNA不能進行單鏈復制。但在噬菌體展示系統中，輔助噬菌體能為噬菌體提供PⅡ蛋白和包裝蛋白，輔助噬菌粒進行DNA復制與噬菌體的包裝，完成對宿主菌的侵染。VCSM13輔助噬菌體可嚴格用于人工改建的噬菌粒以產生scFv[32]。

圖3 輔助噬菌體結構示意圖Fig.3 Schematic diagram of helper phage

3 噬菌體展示技術在疾病防控領域中的應用

在疾病防控領域抗體研究一直是個熱點，故抗體的制備技術與基因工程技術等生命科學領域的發展聯系緊密。最初的抗體研制方法是通過采集免疫后的動物血清以制備多克隆抗體，隨后研制出了特異性較好的鼠源單克隆抗體，但針對異源性動物的病毒性疾病的治療，鼠源單克隆抗體會誘導機體產生免疫反應。隨著科學技術的不斷發展，現已有較多高效的同源性基因工程抗體被制備出來并用于臨床實踐。

3.1 開發人源抗體

1975年，K?hler等[33]首次建立了融合雜交瘤細胞制備單克隆抗體的方法，該方法的建立使具有高親和力的抗體在臨床的應用成為可能[34]。但因為鼠源單克隆抗體在人體內被識別為異源蛋白質，其高度的免疫原性誘導的人源抗小鼠抗體使其臨床功效降低。隨著技術的發展，已逐漸通過抗體工程解決類似問題。如抗體的Fc端易誘導機體產生免疫原性，故可將人源抗體的Fc基因替換鼠源的Fc基因，以降低免疫原性[35]。Almagro等[35]將鼠源抗體可變區基因克隆到人源抗體恒定域的噬菌粒載體以產生嵌合Fab，再用人源VH和VL的表位引導替換鼠源抗體基因，從而實現人源化，最后對人源Fab進行特異性及親和性鑒定。Wang等[36]研發的能中和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的小鼠單克隆抗體是第一個完全人源化抗體藥物，該抗體藥物的發現使同源性抗體在臨床上的使用成為可能。

3.2 保護仔豬免受豬流行性腹瀉病毒感染

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一種具有高度傳染性的冠狀病毒，感染PEDV的新生仔豬可發生嚴重腹瀉和死亡[37]。保護仔豬免受PEDV感染的傳統策略是用滅活或減毒疫苗對懷孕母豬進行免疫，新生仔豬通過吸吮獲得被動免疫，可免受PEDV感染[38-39]。在免疫母豬無法及時產生乳源性免疫或仔豬未能從乳汁中吸取足夠母源抗體的情況下[40]，通過給仔豬飼喂外源中和抗體進行被動免疫是一種有效的預防措施。scFv是最流行的基因工程抗體類型之一[41-42]，Zhang等[43]通過噬菌體展示系統篩選得到與PEDV具有較高親和性的scFv。為驗證scFv是否具有PEDV中和活性，Zhang等[43]進行了病毒蝕斑減少試驗和間接免疫熒光試驗，最終得到3株與PEDV具有中和活性的scFv。在確定抗體特性后，通過間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定，scFv通過與PEDV的S1蛋白結合以抑制病毒感染。動物試驗結果表明，口服scFv可降低仔豬死亡率。作為第1份鑒定豬源scFv對PEDV抗病毒活性的研究，該結果為開發用于治療和預防PEDV引起的腹瀉和基于scFv的藥物奠定了基礎。

3.3 中和傳染性法氏囊病病毒

雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)為雙鏈RNA病毒，其通過侵染法氏囊內B細胞群引起雞高度傳染性的免疫抑制[44]，根據致病性和抗原性進行分組，已鑒定出大量IBDV毒株。雖然已研制出IBDV的單克隆抗體[45-47]，但它們區分各種毒株的能力有限。盡管已研發了針對蛋清、溶菌酶、牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白[48]和鼠血清白蛋白[49]的重組雞抗體，但均未顯示出具有中和等功能性生物活性。Sapats等[50]使用重組DNA技術和噬菌體展示技術構建并表達了雞源scFv，為毒株的區分創造優勢。在該項研究中，從抗體文庫篩選出一系列可特異性結合IBDV的scFv，其中15株在體外對IBDV具有中和病毒作用。作為第1份針對IBDV基因工程雞源抗體的報告，從免疫雞中篩選得到具有中和活性scFv的結果使IBDV的診斷應用成為了可能，這說明了噬菌體展示技術具有用于生產診斷或潛在治療試劑的能力。

3.4 檢測嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2抗原

2019年冠狀病毒病(Coronavirus disease 2019,COVID-19)是由嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的、以肺炎樣癥狀為主的新型傳染病[51]。使用康復患者的血漿進行被動免疫療法被認為是治療SARS-CoV-2感染的一種很有前景的選擇[52]。在全球疾病暴發之際，亟需開發出一種快速、準確且易于制備的診斷試劑。雖然RT-PCR檢測SARS-CoV-2 RNA[53]已獲得美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)的緊急使用授權(Emergency use authorization,EUA)，但其存在很多限制以致于無法做到及時檢測。為能快速檢測開發出SARS-CoV-2，Kim等[54]研發了基于特定橫向流動免疫測定(lateral flow immunoassay,LFIA)的COVID-19生物傳感器，用于直接檢測病毒抗原。 該研究使用了噬菌體展示技術獲得scFv-Fc融合蛋白，用作特異性檢測SARS-CoV-2的抗體。該抗體僅對 SARS-CoV-2 NP 抗原和病毒敏感，不會與其他病毒NP發生交叉反應，該結果有望成為COVID-19的一種簡單快速的診斷方式。

3.5 與新一代SMRT bell測序技術相結合的噬菌體展示技術

噬菌體展示技術與新一代測序技術(next generation sequencing，NGS)相結合是目前從不同文庫中富集和分離單克隆抗體的最先進方法。然而NGS的序列讀取長度(最大500 bp)不足以覆蓋完整的scFv序列(平均近似長度為850 bp)，限制了其在噬菌體展示篩選中的應用[55-56]。而單分子實時(single molecule real-time,SMRT)測序允許對高達8 500 bp的片段進行連續測序，雖然SMRT的讀取長度是以犧牲序列保真度為代價，但其單鏈發卡狀的接頭序列將文庫中的分子拼接成完整的圓環，這種結構有利于進行周而復始的滾環復制，從而消除同一片段的錯誤率，將scFv的序列準確度提高到99.99%[57]。Hemadou等[58]首次證明SMRT測序可有效準確識別富集的全人重組scFv抗體庫中的全長scFv。

3.6 噬菌體展示技術的其他應用

隨著生命科學領域的不斷探索與創新，抗體制備技術越來越被重視。一些無法通過免疫動物分離得到的針對免疫原性低抗原的抗體可借助體外篩選獲得[59]。而通過噬菌體展示技術篩選的scFv不僅具有較高的親和性，還能通過基因工程技術得到抗體的完整氨基酸序列[60]。scFv只具有傳統抗體的Fab段，其CDR3區結構的多樣性可與各表型的靶標抗原結合，又因其缺少Fc段，大大降低了抗體的免疫原性[61]。

目前，噬菌體展示技術的應用較為廣泛，由于多克隆抗體及單克隆抗體等異源抗體在臨床應用時可能會引起機體的免疫反應，選擇噬菌體展示技術可大大減小這種可能性[62]；噬菌體展示技術最大的優點是解決了異源性的抗體基因轉化難的問題，有研究人員還利用該技術體外篩選得到了對呼吸道內皮細胞具有高親和力的抗體[63]。Suárez等[64]開發了噬菌體展示技術在肽介導的血腦屏障給藥系統中的應用。噬菌體展示技術還可聯合高通量測序技術，篩研究各種分子之間相互作用的信息[65-66]。

4 小 結

隨著噬菌體展示技術的不斷發展，其以高庫容量、高效、方便及靈活篩選等優勢迅速成為諸多領域的研究熱點，不僅在新型疫苗的研制方面具有廣闊的應用前景[67]，而且在食品安全、病原微生物及動物病毒性疾病等研究領域中的應用也越來越廣泛[68-69]。但噬菌體展示文庫仍具有局限性，如所展示的抗體并不能完全代表抗體文庫中的所有抗體，可能的原因是從細胞中提取的RNA狀態不佳及后續擴增過程中丟失了關鍵基因。隨著噬菌體展示系統的不斷優化與完善，該技術有望為疾病的防治提供新的思路，在動物生命科學研究領域發揮重要作用。