黃芪多糖對巨噬細胞天然免疫調節的研究進展

劉 倩，郭志廷，張 康，王學智，張景艷，李建喜

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州 730050；2.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070)

黃芪性甘，微溫，入脾、肺、肝、腎經，有“補氣之長”之稱，作為補氣要藥，其調節免疫的作用已經廣為接受。黃芪主要包含生物堿、皂苷類、葡萄糖醛酸、黃酮類、多糖等生物活性物質，其中黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)作為一類生物大分子成分，是免疫活性最強的一類物質。研究發現，APS具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤[1-2]、保護心血管系統[3]，降血糖，抗糖尿病[4]、抗動脈粥樣硬化[5-6]等多種生物學作用。APS能促進動物免疫器官發育、提高外周血中免疫球蛋白含量及T淋巴細胞數量、增強多種疫苗的保護效力，且不會存在藥物殘留的問題。作為飼料添加劑和免疫增效劑，APS可有效提高幼齡動物的抗病力和生長性能[7-8]。但由于生藥黃芪中APS的提取率較低，黃芪價格不斷增高，缺乏有效的特異性檢測方法，造成市場中獸用APS的質量參差不齊，限制了該產品的推廣應用。

天然免疫系統是機體的第一道免疫防御屏障，在抵抗病原微生物感染的過程中起著關鍵性作用。巨噬細胞作為機體重要的天然免疫效應細胞，是機體造血系統中可塑性最強的一類細胞，具有極強的功能多樣性，在機體正常發育、體內平衡、組織修復和抗感染中發揮著重要作用[9-10]。一方面，巨噬細胞吞噬能力強，能識別、吞噬和清除機體衰老細胞及侵入機體的外源性病原微生物，在參與天然免疫應答等方面具有十分重要的作用；另一方面，巨噬細胞能遞呈抗原并激活T細胞而參與特異性免疫應答。巨噬細胞主要分為M1型和M2型，其中M1型巨噬細胞通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子，并專職遞呈抗原，參與正向免疫應答，發揮免疫監視的功能，對于早期抵御畜禽感染性疾病至關重要。中藥有效成分對巨噬細胞極化及功能的影響是目前的研究熱點。作者通過對國內外相關文獻的分析歸納，總結APS提取及結構分析的最新研究進展，闡述其對機體巨噬細胞及相關分子信號通路的調節作用機制，以期為新型畜禽免疫增強劑的研發提供新思路。

1 APS的提取技術和組分分析

1.1 APS的提取及純化方法

APS的提取方法主要有大孔樹脂提取法[11]、水提醇沉法[12]、堿水提法[13-15]、堿醇提法[16]、纖維素酶提法[17]及超聲輔助提取[18]等。APS是黃芪中的水溶性成分，極性偏大，因此多采用水提法進行提取，水提液濃縮后直接醇沉或分級醇沉后可得到不同分子質量的APS。秦哲[19]分別用溫浸法、纖維素酶提取法、水煎法及飽和生石灰水提取法提取APS，發現纖維素酶提取法APS得率最高。經水提醇沉后，APS在純化過程中往往需要進行脫蛋白處理，常用的方法有酶法和Sevage法。胡媛媛等[20]對蛋白酶和Sevage法聯用脫APS蛋白工藝進行優化，發現在酶底比2.0%、pH 5.0、50 ℃水浴酶解24 h時效果最好，蛋白脫除率為89.82%，APS質量分數為83.48%。因此，酶法和Sevage法聯用除蛋白質效果較好且多糖的損失率較低。除蛋白后經透析、冷凍干燥后即得黃芪粗多糖。黃芪粗多糖經不同填料類型的層析柱可進一步得到精制的APS，一般可用離子交換層析柱，常用的有二乙氨乙基纖維素(DEAE系列)及凝膠排阻層析柱 (Sephadex-G系列、Superdex系列等)[21]。

1.2 APS的組分分析

APS是一類結構復雜的生物大分子復合物，因藥材產地、提取與精制工藝的不同[22]，其分子質量和單糖組成的比例存在較大差異。陳艷蕊等[23]采用閃式提取、乙醇沉淀法從黃芪根部提取多種多糖化合物，脫除蛋白、凝膠層析后的多糖化合物經水解、乙酰化后，利用氣相色譜-質譜法分析黃芪水溶性多糖中單糖組成、結構及其比例，發現不同產地如山西、內蒙古、甘肅產APS的單糖種類及各單糖的百分含量有顯著差異。APS含有的單糖組分包括：L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖等，其中最主要的成分是D-葡萄糖和D-甘露糖。唐雨薇等[24]采用DEAE-52和Sephadex G-100色譜柱分離純化，得到2種不同分子質量的黃芪均一多糖APS-Ⅰ(1 060 ku)和APS-Ⅱ(2 470 ku)，通過高效液相色譜(HPLC)、紅外光譜(IR)和環境掃描電鏡(ES-EM)對APS-Ⅰ和APS-Ⅱ進行分析發現，APS-Ⅰ由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為29.12∶1.89∶4.00∶1.35∶1.00∶81.97；APS-Ⅱ由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖組成，摩爾比為50.46∶1.16∶1.00∶2.27∶2.66∶15.72∶7.86。說明不同分子質量APS的單糖組成及其比例不同，其糖鏈連接順序及糖苷鍵類型會有差異，相應的生物活性也會不同。Jiang等[25]采用高效液相色譜從黃芪中分離得到4種不同多糖，其中，APS1與APS2為均一的多糖，分別只含有葡萄糖和阿拉伯糖；APS3含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩爾比為1.00∶10.76∶6.55∶12.00；APS4含有半乳糖和阿拉伯糖，摩爾比為3.02∶1.00，且只有APS2和APS3具有刺激淋巴細胞增殖的活性，說明APS的單糖組成與其生物活性密切相關。

2 ASP對巨噬細胞的調節作用

2.1 ASP對巨噬細胞極化的調節

研究表明，巨噬細胞極化有促炎和促進早期創傷愈合的功能，且在感染、代謝、免疫及腫瘤的發生發展等過程中發揮著重要作用[26-27]。活化的巨噬細胞大致分為M1和M2 2種表型，通常用3種細胞特性來判定，即細胞表面蛋白表達、酶活性及細胞因子分泌。表1總結了一些最常見的表示巨噬細胞極化狀態或增強的標記分子及所采用的檢測方法[28-29]。

對機體的健康而言，巨噬細胞極化是一把雙刃劍，其對機體的影響有好有壞。APS對巨噬細胞極化有雙向調節作用，能發揮抗腫瘤和抑制炎癥的生物學作用。人單核細胞源巨噬細胞(THP-1)M1/M2極化率的降低有利于促進腫瘤生長，Bamodu等[30]采用流式細胞術研究發現，8和16 mg/mL APS可顯著提高THP-1的CD80high-M1/CD206high-M2極化率，顯著減少CD206high-M2巨噬細胞的數目，且16 mg/mL APS可顯著提高經H441肺癌細胞培養上清液孵育的CD80lowCD206highTHP-1的CD80high-M1/CD206high-M2極化率，與脂多糖(LPS，40 ng/mL)/γ干擾素(IFN-γ，200 ng/mL)對細胞的刺激作用相似，可抑制腫瘤細胞增殖。Wei等[29]研究發現，30～100 μg/mL APS誘導的小鼠骨髓源巨噬細胞(BMDMs)可抑制乳腺癌腫瘤細胞(4T1)在BALB/c小鼠體內的增殖及實體瘤生長；采用實時熒光定量PCR法測得APS可刺激BMDMs細胞M1型標記分子(iNOS、IL-6、TNF-α及CXCL10)轉錄水平的顯著升高，顯著抑制M2型標記分子(MR、Arginase-1)轉錄水平；采用流式細胞術測得APS可顯著抑制IL-4(20 ng/mL)誘導的CD86lowCD206high-M2型BMDMs細胞分化。柴長斌等[31]研究發現，小鼠連續7 d腹腔注射2 mg/mL APS，可顯著增加小鼠腹腔巨噬細胞M1型的極化。

此外，APS還可通過下調M1/M2極化率，促進抑炎細胞因子表達，發揮治療疾病的作用。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的主要發病機制是免疫失衡。劉建春等[32]研究發現，0.1 mg/mL APS可顯著增加EAE模型小鼠脾臟M2型巨噬細胞表面標志物CD206的表達，0.1和0.2 mg/mL APS均可顯著抑制M1型巨噬細胞表面標志物CD16/32+的表達，改善炎癥反應的微環境。提示APS對EAE有潛在的治療作用。

2.2 APS對巨噬細胞遷移的作用

巨噬細胞來源于血液中的單核細胞，分布于機體的各個器官與組織中，在微環境改變和信號刺激下可遷移到炎癥、損傷部位，參與機體的各種免疫反應。巨噬細胞的密度和時空分布方式、遷移均可直接或間接地受到外界信號或物質調控。LPS可誘導大鼠子宮中巨噬細胞的數量增加及分布發生變化，單核細胞趨化蛋白(MCP-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)含量升高，誘發胚胎吸收或流產。鄭燕等[33]研究發現，將APS提取物按2 mL/d的劑量灌服大鼠，可有效降低LPS引起的大鼠胚胎吸收率和升高流產率；APS組大鼠環肌外層、環肌內層和功能層中CD14+、α-NAE+巨噬細胞數量和MPC-1含量均顯著低于LPS組大鼠。分析機制可能與APS抑制MCP-1生成減弱巨噬細胞從環肌外層向胚胎著床處聚集、遷移有關。

2.3 APS對巨噬細胞吞噬作用的影響

巨噬細胞的吞噬功能是其識別并消滅病原體、清除衰亡細胞、維持機體內環境穩態的重要手段。寧康健等[34]分別采用灌服、腹腔注射、皮下注射3種給藥途徑將不同劑量的APS提取液作用于昆明小鼠，發現高、中、低劑量(15、20、25 g/(kg·d))APS組的細胞吞噬百分率和吞噬指數均高于對照組，其中以高劑量組(25 g/(kg·d))效果最好；APS腹腔注射組的細胞吞噬百分率高于皮下注射和灌服組。 劉印華等[35]按2 mL/d的劑量連續灌服小鼠APS(5、10、20 mg/mL)10 d，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率及吞噬指數均顯著高于正常對照組。

在免疫抑制環境下，APS也表現出良好的增強巨噬細胞吞噬功能的活性作用，且與劑量存在正相關性。史晶晶等[36]研究發現，給予環磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠不同劑量的APS(0.02、50、100、200 mg/kg)后，小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬百分率和吞噬指數明顯升高，且具有劑量依賴性，以200 mg/kg APS作用最強。Qiu等[37]研究發現，口服不同劑量(50、100、200 mg/kg) APS能改善地塞米松所致免疫抑制犬的臨床癥狀，顯著增強犬腹腔巨噬細胞吞噬活性，并呈現劑量依賴性，以200 mg/kg APS作用最強。與此相似，APS對腫瘤、致病菌感染環境下巨噬細胞的吞噬功能也具有增強作用，且與劑量存在正相關性。Yang等[38]研究發現，100、400 mg/kg APS均能顯著增強H22肝癌小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，抑制肝癌實體瘤的生長。張雷芳[39]研究發現，腹腔注射0.2～3 mg/mL APS能夠促進小鼠腹腔巨噬細胞活化，增強其吞噬和殺傷布魯菌S2株的作用；APS對巨噬細胞吞噬S2的作用具有雙向性，濃度過高時反而有抑制作用。

臨床研究證明，APS可作為疫苗的佐劑，有效提高機體的細胞與體液免疫，提高疫苗的抗體水平。研究發現，在接種疫苗前預先給予APS可提高巨噬細胞的吞噬能力，APS劑量與其增強疫苗特異性免疫應答存在相關性，如在口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫前1 d分別口服1.0 mL不同劑量APS(6.25、12.5、25、50 mg/kg)的小鼠，與單獨接種口蹄疫病毒(FMDV)的小鼠相比，腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數、疫苗抗體滴度均有增高，其中50 mg/kg APS作用最強[40]。

2.4 巨噬細胞炎癥因子的釋放

在炎癥反應中，巨噬細胞會分泌大量促炎因子，如NO、TNF-α、IL-1β等，這類因子會激活更多未活化的巨噬細胞參與炎癥反應，由此形成一個正反饋調節。通常情況下，這一正反饋調節也會受抑炎因子(如IL-4、IL-10、TGF等)的調控；然而在某些情況下，這種調節機制失靈，造成過度炎癥反應，進而引起機體損傷。一定濃度范圍(12.5～300 μg/mL)內的APS可通過雙向調控促炎、抑炎因子的表達，增強巨噬細胞的天然免疫功能，從而發揮抗炎、抗腫瘤等生物學作用。

一方面，APS可促進正常巨噬細胞中促炎因子的表達，激活巨噬細胞，具有與低濃度(不引起毒性反應)LPS相似的生物學作用。研究發現，分子質量為1 334 ku、總糖含量為76.5%、濃度為30～300 μg/mL的APS可刺激RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6和iNOS蛋白與基因轉錄水平的表達量升高，該作用與100 ng/mL LPS的作用相似，且與APS濃度呈正相關性[41]；用25 μg/mL APS孵育RAW 264.7細胞24 h后，上清中分泌的細胞因子NO、TNF-α和IL-6含量顯著升高，與100 ng/mL LPS作用相似[42]。 其他研究報道也表明，一定濃度的APS(12.5、25、50、100 μg/mL)作用于RAW264.7細胞24 h后，均能促進巨噬細胞產生TNF-α、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、NO、IL-6和IL-1β，且與APS濃度呈正相關性[43]。Zhou等[44]發現，APS與1 μg/mL LPS的作用相似；孟婷婷[45]還發現100 μg/mL APS可以顯著降低NF-κB抑制劑二硫氨基甲酸肽吡咯烷(PDTC)刺激引起的RAW264.7細胞IL-1β、TNF-α、IL-6及iNOS表達水平降低。APS對魚頭腎巨噬細胞、THP-1細胞等不同來源的巨噬細胞也表現出促進促炎因子釋放的作用，一定濃度的APS能顯著增強巨噬細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達，且隨著APS孵育時間(6、12、24 h)的延長，增加趨勢逐漸降低[46-47]。Yang等[38]研究發現，100和400 mg/kg APS能顯著增加H22肝癌小鼠腹腔巨噬細胞促炎因子IFN-γ、IL-2、IL-12和TNF-α細胞因子的釋放，顯著減少抑炎因子IL-10的釋放，且APS濃度為400 mg/kg時作用效果最顯著。因此，APS可以通過釋放炎癥因子改善宿主機體的免疫反應，發揮體內抗腫瘤活性。周麗菁等[48]研究表明，300 μg/mL APS作用于THP-1細胞24 h后可顯著促進細胞NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，但對IL-12無顯著影響。體內研究也有一致性的發現，Xu等[49]研究表明，不同濃度(0.05、0.2、0.6、1.5、4、8 mg/mL)APS均可激活小鼠腹腔巨噬細胞，顯著促進促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，其達到最高分泌水平的APS濃度分別為4、1.5和4 mg/mL。

另一方面，APS可抑制炎癥損傷下巨噬細胞中促炎因子的過度釋放，保護和調節巨噬細胞免疫功能，發揮抗炎、抗腫瘤的生物學作用。研究發現，APS對LPS誘導的RAW264.7細胞損傷具有保護作用，100、500、1 000 μg/mL APS均能夠顯著降低1 μg/mL LPS誘導損傷細胞中促炎因子IL-1β和TNF-α的分泌，與APS濃度呈正相關性，其中1 000 μg/mL APS作用24 h效果最為顯著，且APS作用優于人參多糖(GPS)[50-51]；1 mg/mL APS能顯著抑制100 ng/mL LPS誘導的THP-1細胞分泌過量的IL-1β和IL-6，從而達到免疫調節作用[52-53]；不同濃度(37.5～150 μg/mL)APS作用24 h均能抑制1 μg/mL LPS誘導的人單核巨噬細胞系(U937細胞)產生過量的TNF-α、IL-1β和NO[54]；APS可顯著抑制LPS誘導的大鼠子宮巨噬細胞TNF-α的過量生成，對流產大鼠子宮的免疫微環境發揮調節作用[33]。

2.5 相關信號通路

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類天然免疫模式識別受體，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，在病原微生物免疫和誘導快速防御反應激活固有免疫系統中具有重要作用。其中，TLR4受體是第一個在膜表面發現的Toll蛋白，可以識別革蘭氏陰性菌的LPS。TLR4信號轉導途徑包括TLR4-TIRAP/MAL途徑(MyD88依賴途徑)和TLR4-TRAM/TIRF途徑(MyD88非依賴途徑)。巨噬細胞表面分子TLR4在APS主導的免疫調節中發揮重要作用，其中TLR4-TIRAP/MAL-MyD88依賴途徑是APS調節巨噬細胞功能的主要途徑。

APS可通過識別正常巨噬細胞TLR4，激活TLR4-MyD88依賴信號轉導通路，促進NF-κB核轉位及轉錄水平的表達，從而活化巨噬細胞，發揮對機體的免疫調節作用(圖1)。 研究發現，25～400 μg/mL APS作用于RAW264.7細胞后，與空白對照組相比，關鍵信號通路TLR4、MyD88、NF-κB、TRAF-6基因表達和蛋白水平都有明顯的上調[44，55]。其中，APS作用于RAW264.7細胞4 h后NF-κB(p65)開始活化，6 h達到高峰，并維持到8 h[56]。孟婷婷[45]研究發現，隨著APS濃度的升高，NF-κB(p65)入核表達水平升高。Wei等[41]研究發現，1 μg/mL APS作用RAW264.7細胞后能激活TLR4信號通路下游的MAPKs相關蛋白，包括磷酸化的細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,c-JNK)和磷酸化的p38，誘導NF-κB易位及NF-κB抑制因子α(IκBα)降解。Feng[43]也有相類似的發現，25～100 μg/mL APS能提高RAW264.7細胞中NF-κB(p65、p38)和JNK細胞外信號調節激酶的蛋白水平，表明APS的免疫調節作用是通過激活NF-κB(p65)MAPK信號通路介導的。

此外，APS還可抑制炎癥損傷下巨噬細胞信號通路中相關蛋白的過度表達，保護和調節巨噬細胞的免疫功能，發揮抗炎的生物學作用(圖2)。 研究發現，0.1、0.5、1 mg/mL APS均可顯著抑制1 μg/mL LPS刺激損傷RAW264.7細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達量的升高[57]，表明APS可能通過抑制TLR4/NF-κB的活化從而緩解LPS誘導引起的巨噬細胞過度炎癥反應，減少免疫應激。

圖2 APS對LPS損傷巨噬細胞TLRs信號通路調節示意圖Fig.2 Schematic diagram of TLRs signaling pathway on LPS induced injured macrophages regulated by APS

3 小 結

臨床實踐中，APS常與疫苗相結合，用于提高畜禽的特異性免疫應答反應[58-60]。此外，單獨使用APS也可提高幼畜禽的抗感染能力，改善健康水平，提高免疫球蛋白指數，增強機體天然免疫水平[61-64]。鑒于APS良好的臨床功效，近年來有關其提取工藝、組分表征及對機體天然免疫調節作用的研究屢見不鮮。目前，APS的提取工藝不盡相同，加之藥材產地、藥材質量及提取純化方法的不同，導致用于藥理學試驗研究的APS在純度、分子質量及單糖組成上均存在一定差異。因而，APS調節巨噬細胞功能及其相關機制的研究中存在有效劑量及活性作用不一致性的問題。研究表明，APS的單糖組成與其生物學作用存在關聯性，但因現有檢測技術的壁壘，一直以來植物多糖成分的全面分析和表征存在難點。因此，APS生物學活性作用的評價與機制研究還需要進一步借助現代檢測技術的完善與發展才能得到更為準確和全面的闡述。

綜合已有文獻發現，APS的安全劑量范圍大，對巨噬細胞的調節存在雙向性，可通過識別TLR4、激活TLR4-MyD88依賴信號轉導通路，促進NF-κB核轉位及轉錄水平的表達，活化巨噬細胞，發揮免疫增強作用；也可通過抑制炎癥損傷巨噬細胞中TLR4、TLR2信號通路中相關蛋白的過度表達，減少促炎因子的釋放，發揮抗炎的生物學作用。但目前這類研究均集中在人源、鼠源巨噬細胞上，缺乏對畜禽如雞、豬、牛等巨噬細胞的分子調節機制研究。人們對機體天然免疫調節的認識還在不斷發展之中。因此，APS對畜禽巨噬細胞的免疫調節作用及其分子機制研究對于支撐中國畜禽綠色養殖技術的發展將具有重要意義。