綿羊IGF1R基因多態性及其與生長性狀的關聯分析
2022-05-31 08:00:18馮登偵
中國畜牧獸醫 2022年5期
強 浩，梁 鵬，孟 科，榮 軒，馮登偵
(寧夏大學農學院，銀川 750021)
灘羊是寧夏地區優勢特色品種，不僅裘皮品質好，而且肉質鮮嫩多汁[1-2]。但灘羊生長發育慢，產肉量較低，一般一年一產且為單胎，限制了羊產業的發展，故引進小尾寒羊，又以杜泊羊為終端父本進行三元雜交，培育出生長發育快、產肉性能高、肉質風味優和繁殖力較高的肉羊新品種(系)，以推動當地的肉羊產業發展。
胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)是一種細胞表面受體，屬于酪氨酸激酶受體超家族，同時也是胰島素樣生長因子 (insulin-like growth factor,IGF)系統非常重要的組成部分，IGF系統包括IGF配體(IGF1、IGF2)、IGF受體(IGFR)和IGF結合蛋白(IGFBPs)，在所有脊椎動物的神經內分泌生長發育調節中起著核心的作用[3-5]。IGF1R由2個α亞基和2個β亞基構成，α和β亞基均由單個mRNA前體合成，前體糖基化，蛋白水解切割，并通過半胱氨酸鍵交聯以形成功能性跨膜αβ鏈，α鏈位于細胞外，而β亞基跨膜，負責配體刺激后的細胞內信號轉導。IGF1R基因多態性對動物的生長有一定的影響，Wu等[6]利用PCR-RFLP方法檢測發現邊雞IGF1R基因存在2個多態位點，分別位于外顯子2和3上，在8、14、16和18周時，具有AluⅠ酶切位點的AA基因型個體體重高于AB基因型個體；Hin1 Ⅰ酶切位點的CD基因型個體在6、8、10、12及14周時體重高于CC基因型個體。通過生物進化樹分析發現，絕大多數哺乳動物IGF1R基因很保守[7]，其廣泛表達于動物的肌肉、皮膚、大腦、骨骼等組織內[8-11]。IGF1R是IGF1和IGF2發揮功能的關鍵受體[12-14]，IGF1R以高親和力結合IGF1，同時也可與IGF2結合，盡管親和力較低，但在胎兒發育過程中也具有促進有絲分裂的作用。IGF1R下游主要激活PI3K/Akt、mTOR、MAPK/ERK和JAK/STAT等信號通路[15-16]，進而調控細胞增殖、分化、細胞周期、自噬和凋亡，是細胞正常生長所必需的調節受體。
本試驗選取灘羊、杜泊羊和小尾寒羊3個綿羊品種作為研究對象，使用液相捕獲測序[17-18]對IGF1R基因靶向測序，分析IGF1R基因在3個綿羊品種中的單核苷酸多態性(SNP)和插入缺失(InDel)，并進行差異分析，篩選出3個群體間差異顯著的位點后，利用飛行質譜檢測方法在其雜交后代中進行SNP分型，并與生長性狀表型數據進行關聯分析，以期為今后的品種選育和改良提供基礎數據。
1 材料與方法
1.1 材料
隨機選取杜泊羊(D，n=30)、灘羊(T，n=30)和小尾寒羊(H，n=31)為試驗動物，91只羊均為健康、發育正常的成年羊，使用EDTA抗凝采血管頸靜脈采血，-20 ℃保存，用于IGF1R基因靶向測序，篩選差異位點。隨機選取3個品種健康、發育正常的子代羊383只(表1)，統一取右耳耳尖組織，浸于75%酒精中，-20 ℃保存，用于SNP分型及關聯分析。
表1 不同雜交后代群體數量及來源
1.2 方法
1.2.1 基因檢測 通過查閱國內外文獻和Ensemble數據庫，確定IGF1R基因上28個與生長發育相關的SNPs突變，由北京康普森農業科技股份有限公司進行引物和芯片設計，采用捕獲測序技術對本試驗91個樣本進行檢測，測序結果與綿羊參考基因組(Oar_rambouillet_v 1.0)進行比對分析。
1.2.2 SNP、InDel檢測及注釋 采用SAMTOOLS軟件進行個體SNP及InDel檢測，并利用ANNOVAR軟件對檢測結果進行注釋。
1.2.3 生長發育性能測定 測定383只子代羊初生、3月齡的體重、體高(鬐甲頂點至地面的垂直高度)、體斜長(肩端至坐骨結節的后端的距離)、胸圍(沿肩胛骨后緣量取的胸部周徑)。
1.2.4 SNP基因分型及關聯分析 根據篩選的SNPs位點，將383只子代羊耳組織交由北京康普森農業科技股份有限公司使用飛行質譜分型檢測技術進行SNP基因分型，并與不同階段生長性狀表型數據進行關聯分析。
1.3 數據統計分析
使用Excel 2019對數據進行整理，計算各位點的基因頻率和基因型頻率，以及群體遺傳學參數：純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)、多態信息含量(PIC)，并進行χ2檢驗，分析其是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態。
利用SPSS 22.0軟件對個體基因型與生長性狀進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，使用Haploview 4.2軟件進行位點之間的連鎖不平衡分析。數據以平均值±標準誤表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。
2 結 果
2.1 3個綿羊品種IGF1R基因突變位點篩選
對3個綿羊品種共計91只綿羊IGF1R基因進行靶向測序，共檢測到347個突變位點，包含335個SNPs，12個InDel，有2個位點同時發生了SNP和InDel突變。其中，內含子區突變位點333個，外顯子區突變位點8個，5′-UTR區突變2個，3′-UTR突變2個。共檢測到175種突變類型，有93種突變發生頻次低于5次，基因型頻率過低，群體間無差異，無需進行下一步分析，由于內含子區域的位點較多，所以本試驗僅對外顯子區SNPs和品種間差異顯著的位點進行研究，共8個：g.7628315 T>C、g.7628528 T>C、g.7628690 C>T、g.7833817 C>T、g.7836687 C>T、g.7840691 T>C、g.7855904 C>G、g.7872277 C>T(表2)。
表2 IGF1R基因突變區域和位點數
2.2 3個群體IGF1R基因外顯子區域突變位點遺傳結構分析
由表3可知，除g.7855904 C>G位點發生顛換外，其余7個SNPs位點的突變類型均為轉換，且8個SNPs位點均為同義突變，編碼的氨基酸未發生改變。g.7628315 T>C和g.7840691 T>C位點在群體間差異顯著，其余6個SNPs位點在群體間表現為差異極顯著。8個SNPs位點在3個群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(小尾寒羊g.7628690 C>T位點除外)。基因型頻率和基因頻率顯示，8個SNPs位點在3個群體中野生型均多于突變型，杜泊羊在g.7836687 C>T位點，灘羊在g.7628528 T>C、g.7628690 C>T和g.7872277 C>T位點均未發生突變。多態信息含量數據顯示，g.7628528 T>C和g.7872277 C>T位點在3個群體中均表現為低度多態(PIC<0.25)，其中杜泊羊的雜合度和有效等位基因數均高于小尾寒羊和灘羊；g.7833817 C>T位點在3個群體中均表現為中度多態(0.25
2.3 試驗群體質譜分型
利用飛行質譜法對群體間差異極顯著的6個SNPs位點及差異顯著的2個SNPs位點在子代F1、F2、H1、H2中進行SNP基因分型，結果顯示，g.7628528 T>C、g.7628690 C>T、g.7833817 C>T、g.7628315 T>C、g.7840691 T>C和g.7872277 C>T位點均存在TT、TC(CT)、CC 3種基因型，g.7836687 C>T位點只有CC和CT 2種基因型，g.7855904 C>G位點存在CC、CG、GG 3種基因型。g.7833817 C>T、g.7836687 C>T和g.7855904 C>G 3個位點的分型圖見圖1。
A，g.7833817 C>T；B，g.7836687 C>T；C，g.7855904 C>G圖1 IGF1R基因外顯子SNPs位點基因分型結果Fig.1 Genotyping results of IGF1R gene exon SNPs
2.4 IGF1R基因外顯子突變位點與綿羊生長性狀的關聯分析
對IGF1R基因外顯子SNPs位點不同基因型個體與綿羊初生、3月齡生長性狀進行關聯分析，結果見表4～11。由表4～11可知，g.7628528 T>C位點在F2代群體中，TC基因型個體3月齡體重、胸圍顯著高于TT基因型(P<0.05)，在H2代群體中，TC基因型個體初生胸圍顯著高于TT基因型(P<0.05)；g.7628690 C>T位點在H2代群體中，TC基因型個體初生胸圍顯著高于CC基因型(P<0.05)；g.7833817 C>T位點在F2代群體中，TC基因型個體3月齡體高顯著高于TT和CC基因型(P<0.05)，TT、CC基因型間差異不顯著(P>0.05)。
g.7836687 C>T位點在F1代群體中，TC基因型個體3月齡體重、胸圍均顯著高于CC基因型(P<0.05)，在F2代群體中， CC基因型個體3月齡體高顯著高于TC基因型(P<0.05)；g.7855904 C>G位點在F1代群體中，CC基因型個體3月齡胸圍顯著高于GG基因型(P<0.05)，與CG基因型間差異不顯著(P>0.05)，在F2代群體中，CC和CG基因型個體初生胸圍顯著高于GG基因型(P<0.05)；g.7872277 C>T位點在H1代群體中，CC基因型個體3月齡胸圍顯著高于CT基因型(P<0.05)，H2代群體中，CT基因型個體初生體重、體高、胸圍均顯著高于CC基因型(P<0.05)，而CC基因型個體3月齡體高顯著高于CT基因型(P<0.05)；g.7628315 T>C位點在F1群體中，TT基因型個體3月齡體高顯著高于TC和CC基因型(P<0.05)，TT、CC基因型個體3月齡體斜長顯著高于TC基因型(P<0.05)，TT、CC基因型間差異不顯著(P>0.05)，在H2代群體中，TT基因型個體3月齡體高顯著高于TC基因型(P<0.05)；g.7840691 T>C位點基因型與各群體階段生長性狀均無顯著關聯(P>0.05)。
2.5 連鎖不平衡分析
使用Haploview軟件對所有SNPs位點進行連鎖不平衡分析，并構建單倍型，結果見圖2。由圖2可知，這8個SNPs位點存在2處強連鎖：其中，g.7628315 T>C和g.7628528 T>C位點形成了Block 1區域，產生3種單倍型：CT、TT和CC，分別命名為：H1、H2和H3，占比分別為0.227、0.668和0.103；g.7833817 C>T和g.7840691 T>C位點形成了Block 2區域，產生3種單倍型：CC、CT和TT，分別命名為：H4、H5和H6，占比分別為0.101、0.508和0.392。將g.7628315 T>C和g.7628528 T>C位點產生的3種單倍型組合后形成了6種基因型，其中H2H2基因型占比最高；g.7833817 C>T和g.7840691 T>C位點產生的3種單倍型組合后形成了6種基因型，其中H5H6基因型占比最高。
圖2 連鎖不平衡分析Fig.2 Linkage disequilibrium analysis
2.6 單倍型組合與綿羊生長性狀的關聯分析
g.7628315 T>C-g.7628528 T>C、g.7833817 C>T-g.7840691 T>C位點單倍型組合與綿羊生長性狀的關聯分析結果見表12、13。由表12可知，H2H2基因型個體在群體中數量最多，H3H3基因型個體數量最少，H3H1基因型個體初生體斜長顯著高于H3H2基因型(P<0.05)，H2H2基因型個體3月齡體高顯著高于H1H2基因型(P<0.05)，其余生長指標在各組合基因型間差異均不顯著(P>0.05)。由表13可知，H5H6基因型個體在群體中數量最多，H4H4基因型個體數量最少，H4H5基因型個體3月齡體斜長顯著高于H4H6基因型(P<0.05)，其余生長指標在各組合基因型間差異均不顯著(P>0.05)。
表12 g.7628315 T>C-g.7628528 T>C位點單倍型組合與綿羊生長性狀的關聯分析
表13 g.7833817 C>T-g.7840691 T>C位點單倍型組合與綿羊生長性狀的關聯分析
3 討 論
本研究以杜泊羊、灘羊、小尾寒羊3個群體共91只綿羊作為試驗動物，通過靶向測序技術在已知的IGF1R基因與生長發育相關的28個SNPs位點附近進行測序，篩選了群體間差異顯著的8個外顯子SNPs，通過飛行質譜分型技術對3個群體的子代進行了差異位點的SNP分型[19]，并與生長性狀進行關聯分析，獲得一些新的遺傳標記。田佺等[20]、張磊等[21]分別對延邊黃牛MEG3基因、東佛里生羊MSTN基因進行多態性檢測及其與生長性狀的關聯分析，均發現了在生長性狀中的優勢基因型；張琪等[22]在松遼黑豬METTL基因的多態性研究中發現，位于外顯子4上A62G位點的GG基因型個體總產仔數、產活仔數和斷奶仔豬數均顯著高于其他基因型個體。目前，有關基因多態性的研究結果較多[23-25]，這對于現代畜牧的選育選配有非常積極的意義，有效地加快了品種培育的遺傳進展。
群體遺傳變異程度反映了群體遺傳多樣性的豐富度，常用多態信息含量(PIC)來衡量，其值的高低能夠反映群體內個體的均質度，數值越大表明該群體的遺傳多樣性越豐富，遺傳潛力越大，對育種改良越有利[26-27]。本研究中，研究群體多呈中度多態和低度多態，g.7833817 C>T位點在3個綿羊群體中雜合度和純合度接近，說明這個位點的等位基因在3個綿羊群體中分布均勻，具有較好的遺傳潛力；g.7628315 T>C和g.7855904 C>G 2個位點在杜泊羊和小尾寒羊2個群體中都具有較好的豐富度；g.7628690 C>T、g.7836687 C>T和g.7840691 T>C 3個位點僅在杜泊羊或灘羊群體中呈現中度多態，選擇潛力較低；g.7628528 T>C和g.7872277 C>T 2個位點在3個綿羊群體中均呈低度多態，說明3個綿羊群體在這2個位點的基因型較單一，選擇潛力較差，且2個位點都表現為野生型遠多于突變型，說明突變型未發生明顯的有利變異，群體基數較小。χ2檢驗結果表明，除小尾寒羊g.7628690 C>T位點外的其余位點均符合Hardy-Weinberg平衡，3個綿羊群體絕大多數位點沒有受到人工選育、遷徙和遺傳漂變等因素的影響，保證了研究樣本的可靠性，可進行下一步與綿羊生長性狀的關聯分析。
IGF1R基因是影響生長發育的關鍵基因，在非綜合征性矮小兒童中，使用MLPA對IGF1R和其他公認的身高相關基因(如SHOX和GH)的拷貝數變異(CNV)進行診斷檢查可以判斷是否身材矮小，用于識別生長發育不良的患者并考慮激素治療[28]。IGF1R基因的雜合突變會導致胎兒在子宮內和出生后生長遲緩、小頭畸形，這種突變還會導致不同程度的精神活動遲緩和畸形[29-32]。同時，具有IGF1純合缺失或突變的個體患有嚴重的宮內和出生后生長障礙、小頭畸形、智力障礙、感音神經性耳聾等特征[33]，IGF1R基因的CNV可能導致產前和產后生長受限[34-36]，這些研究均表明IGF1R基因在機體的生長發育過程中起重要的作用。劉亞楠等[37]通過分析河北和北京地區中國荷斯坦牛群體產奶量和乳成分性狀的遺傳效應發現，IGF1R基因主要影響乳蛋白量性狀，同時對產奶量和乳脂量也具有一定遺傳效應；宋姍姍等[38]對水貂IGF1R基因進行SNP檢測，發現了2個位于外顯子上的突變，進一步與生長發育性狀進行關聯分析發現，c.207G>A位點與金州黑水貂和咖啡水貂體長均呈顯著相關,其中GG基因型為水貂體長的優勢基因型；c.1782G>A與咖啡水貂的體長和體重均呈顯著或極顯著相關，GA基因型作為咖啡水貂的優勢基因型，體長、體重均顯著高于純合基因型個體。以上研究結果表明，IGF1R基因多態性與動物的生長發育指標息息相關。在其他動物上，孫鵬翔等[39]對雞IGF1R基因AluⅠ位點進行多態性檢測，結果表明，共檢測到AA、AB和BB 3種基因型，關聯分析發現該位點對腿肌率有顯著影響，而對其余屠宰性狀的影響均不顯著；高鳳華等[40]研究了IGF1R基因外顯子4和13突變對高、低腹脂系肉雞生長和體組成(龍骨長、脛骨長、脛骨重、股骨重)性狀的影響，發現這2個突變對7周齡體組成和5周齡體重均具有顯著影響；王佩佩等[41]研究了IGF1R基因7個SNPs對雞體重性狀的影響，發現其中2個SNPs對部分周齡體重具有顯著影響。本研究中，g.7628528 T>C位點與F2代3月齡體重和胸圍、H2代初生胸圍均呈顯著相關，TC為優勢基因型；g.7628690 C>T位點與H2代初生胸圍呈顯著相關，TC為優勢基因型；g.7833817 C>T位點與F2代3月齡體高呈顯著相關，TC為優勢基因型；g.7836687 C>T位點與F1代3月齡體重和胸圍均呈顯著相關，TC為優勢基因型，與F2代3月齡體高呈顯著相關，CC為優勢基因型；g.7855904 C>G位點與F1代3月齡胸圍，F2代初生胸圍均呈顯著相關，C為優勢基因；g.7872277 C>T位點與H1代3月齡胸圍，H2代初生體重、體高、胸圍，以及3月齡體高均呈顯著相關，CT為初生優勢基因型，CC為3月齡優勢基因型；g.7628315 T>C位點與F1代3月齡體高、體斜長，H2代3月齡體高均呈顯著相關，T為優勢基因；g.7840691 T>C位點基因型與各階段生長性狀均無顯著相關，進一步驗證了IGF1R基因多態性可以影響動物生長發育性狀。
生長性狀是受微效多基因控制的數量性狀，多個突變位點的連鎖作用對生物表型性狀變化的影響較單個位點變化更大，單倍型組合分析考慮了非等位基因間的相互作用及多個變異位點間的連鎖不平衡，這種組合分析具有更好的統計效力。本研究對8個SNPs位點進行連鎖不平衡分析發現，g.7628315 T>C-g.7628528 T>C位點連鎖后產生6種單倍型組合，H2H2基因型個體在群體中的數量最多，H3H1基因型個體初生體斜長顯著高于H3H2基因型，H2H2基因型個體3月齡體高顯著高于H1H2基因型；g.7833817 C>T-g.7840691 T>C位點連鎖后產生6種單倍型組合，其中H5H6基因型個體在群體中的數量最多，H4H5基因型個體3月齡體斜長顯著高于H4H6基因型。
本研究中發現的8個外顯子突變類型均為同義突變，編碼的氨基酸未發生改變，但有研究表明，同義突變雖未改變蛋白質的氨基酸序列，但或許可以通過密碼子偏愛性、mRNA穩定性影響蛋白質的折疊與合成，進而影響蛋白質的構象和功能[42]，本試驗中發現的差異是否是由于這種同義突變下單個堿基不同造成的仍有待進一步研究。
4 結 論
本研究以在親本群體中篩選的IGF1R基因8個SNPs位點為基礎，利用飛行質譜技術對子代群體進行SNP分型關聯分析顯示，8個外顯子突變位點基因型與各世代綿羊生長發育性狀有顯著關聯，同時g.7628315 T>C-g.7628528 T>C和g.7833817 C>T-g.7840691 T>C位點具有連鎖不平衡現象，且雙倍型在生長性狀上也表現出差異性。 因此，可以將g.7628315 T>C、g.7628528 T>C、g.7628690 C>T、g.7833817 C>T、g.7836687 C>T、g.7840691 T>C、g.7855904 C>G、g.7872277 C>T 8個位點作為優質肉羊培育中生長性狀的潛在分子標記，在今后的育種工作中加強關注，以達到分子輔助育種的目的。
