健康奶牛生殖道乳酸菌的分離鑒定及其抑菌活性研究

孫 艷，馮曉微，劉佳瑋，劉 蓓，靳天雄，馮鳴鵲，劉明超

(河北農業大學動物醫學院，保定 071001)

奶牛子宮內膜炎是常發的奶牛產后疾病，根據臨床表現可分為臨床型子宮內膜炎和亞臨床型子宮內膜炎[1]。病原微生物感染是引發奶牛子宮內膜炎的主要原因，其中以大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)和化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes，T.pyogenes)最常見，發病率在15%左右[2]，該病會導致奶牛的產犢間隔延長，使患病牛的生育率降低，是危害奶牛養殖業的主要疾病之一[3]，給養牛業造成了巨大的經濟損失。近年來，隨著奶牛養殖業的規模化，子宮內膜炎發病率出現明顯的上升趨勢，該病嚴重危害了奶牛養殖業的發展[4]。中國對奶牛子宮內膜炎的治療方法主要是使用抗生素治療，長期以來抗生素類獸藥的不當使用，不僅造成了病原菌嚴重的交叉耐藥，且可能會影響奶制品消費群體的身體健康[5-6]。因此，找到一種可替代抗生素治療和預防奶牛子宮內膜炎的安全高效、無殘留、無污染的綠色制劑已成為奶牛子宮內膜炎防治研究的重要工作。研究表明，乳酸菌通常存在于人類的陰道及胃腸道中[7]，也存在于奶牛的陰道中[8]，是健康奶牛生殖道內的常駐菌群[9]。長期食用含乳酸菌的食品可改善機體陰道中的菌群[10]，且在圍產期奶牛陰道內灌注乳酸菌，能顯著提高機體的免疫反應，降低子宮內膜炎的發病率和子宮感染的發生率[11]。Genis等[12]研究結果表明，益生菌(鼠李糖乳桿菌、酸乳球菌和雷氏乳桿菌)組合在減少子宮內膜上皮細胞和組織中的炎癥及由大腸桿菌引起的感染等方面具有一定的作用，且目前使用益生菌菌株已被提議作為預防產后子宮感染和活體炎癥的一種替代方法。宋鵬杰等[13]從奶牛生殖道中分離出植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌，以上3種奶牛生殖道乳酸菌培養的上清液對大腸桿菌、無乳鏈球菌及金黃色葡萄球菌均表現出良好的抑制效果。石麗穎等[14]報道，從奶牛生殖道中分離的乳酸菌、殊異腸球菌和絨毛腸球菌對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有良好的抑菌效果。本試驗旨在通過分離鑒定奶牛生殖道內的益生乳酸菌，為防治奶牛子宮內膜炎提供綠色環保、無污染、無殘留的新型微生物制劑，同時為進一步研究和開發用于防治奶牛子宮內膜炎的微生態制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所涉及樣品均采集自保定市滿城區某奶牛養殖場10頭產后25～50 d的健康奶牛。大腸桿菌O111∶K58(B4)(菌株編號：CVCC1450)和鼠李糖乳桿菌GR-1(菌株編號：ATCC 55826)均由中國農業大學營養與免疫實驗室惠贈；MRS和LB培養基均購自北京奧博星生物技術有限公司；DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；細菌生化鑒定管購自青島海博生物技術有限公司；慶大霉素、青霉素及四環素等12種藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司；蛋白酶K和過氧化氫酶購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 樣品采集

選擇產后子宮復舊良好、卵巢無異常的奶牛進行采樣。用清水將奶牛外陰部擦洗干凈，再用0.1%的新潔爾滅溶液進行擦洗消毒。在子宮頸口附近收集生殖道分泌物，置于無菌的50 mL離心管中(裝有20 mL滅菌MRS肉湯)，并用封口膜封閉管口，標記牛的編號和日期。樣品采集后放于冰盒中，4 h內送實驗室進行分離培養。

1.3 細菌分離培養與純化

將采集到的樣品置于液體培養基中富集培養18～24 h，富集完成之后，取100 μL涂布于MRS平板上，37 ℃厭氧培養18～24 h，挑出平板上生長的單個菌落，MRS固體培養基平板上劃線培養18～24 h。重復之前的步驟2～3次，直至分離出的菌落形態、顏色、大小一致。

1.4 形態特征觀察

挑取單個菌落進行涂片，革蘭染色后進行鏡檢，觀察菌體形態特征。

1.5 16S rDNA基因序列鑒定

利用DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，采用V3區通用引物(338F:5′-CCTACGG-GAGGCAGCAG-3′，518R：5′-ATTACCGCGGCT-GCTGG-3′)對16S rDNA V3區擴增。 PCR反應體系25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果輸入NCBI核酸數據庫進行比對分析。

1.6 具有抑菌活性乳酸菌菌株的篩選

將初篩菌株接種于MRS液體培養基中厭氧靜置培養18 h后，用牛津杯法測其抑菌活性，選擇對主要致病菌大腸桿菌抑菌活性最強的菌株進行試驗。將待測乳酸菌懸液12 000 r/min離心20 min，將牛津杯放入病原菌平板上，取240 μL乳酸菌上清液加入牛津杯中，每個菌株做3個重復，對照組添加等量的無菌蒸餾水，將平板放入恒溫培養箱中37 ℃培養48 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.7 乳酸菌主要抑菌物質分析

1.7.1 有機酸排除試驗 為消除有機酸對抑菌能力的影響，按照1.6方法取上清，使用1 mol/L NaOH溶液將乳酸菌上清液的pH調整為7.0，以大腸桿菌作為指示菌，以未處理的乳酸菌上清液為對照，用牛津杯法測定抑菌物質是否為有機酸。

1.7.2 細菌素排除試驗 為消除蛋白類對抑菌能力的影響，按照1.6方法取上清，每1 mL上清液中加入1 mg/mL蛋白酶K，37 ℃水浴處理3 h，以大腸桿菌作為指示菌，以未處理的乳酸菌上清液為對照，用牛津杯法測定抑菌物質是否含有細菌素。

1.7.3 過氧化氫排除試驗 為消除過氧化氫對抑菌能力的影響，按照1.6方法取上清，向上清液中添加濃度為10 mg/mL過氧化氫酶溶液，37 ℃水浴處理1 h，以大腸桿菌作為指示菌，以未處理的乳酸菌上清液為對照，用牛津杯法測定抑菌物質是否含有過氧化氫。

1.8 生長曲線繪制

取出凍存的菌液，在超凈臺中用接種環蘸取菌液放入事先配制好的已滅菌的MRS肉湯培養基中，活化3次，37 ℃厭氧靜置培養12～14 h，備用。取活化后的乳酸菌按1%比例接種于MRS肉湯培養基中，充分混合均勻后分別吸取5 mL混合液置于13個5 mL無菌離心管中，分別培養0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h，測量600 nm波長下的吸光度。 選用未接種乳酸菌的MRS液體培養基作空白對照，選用接種鼠李糖乳桿菌的MRS液體培養基作陽性對照。 測定前用渦旋振蕩器搖勻，若菌液濃度太大，應適當稀釋之后進行測量。 記錄數據，以時間為橫坐標，D600 nm值為縱坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.9 產酸能力曲線繪制

方法同1.8，最后使用pH計分別測定各個試管中乳酸菌菌液的pH，以時間為橫坐標，pH為縱坐標，繪制菌株的產酸能力曲線。

1.10 乳酸菌藥物敏感性試驗

在乳酸菌平板上挑取乳酸菌，接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，使用MRS培養基將菌液濃度調整為3×106CFU/mL，涂布在平板上，室溫放置5 min，用鑷子將抗菌藥紙片貼于平板上，37 ℃厭氧培養18 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

2 結 果

2.1 乳酸菌的分離培養與形態觀察

應用MRS瓊脂培養基對10個健康奶牛生殖道分泌物樣本中存在的乳酸菌進行分離純化，結果共分離得到13株革蘭陽性菌，分離的菌株經純化后，菌落呈乳白色或白色，大小均一，邊緣整齊，濕潤光滑。菌體形態一般為短桿狀或球形，根據菌落形態特征以及革蘭染色結果，初步鑒定上述13株菌株為乳酸菌。將13株菌暫時命名為21、23、25、26、31、32、33、34、35、41、45、46和47號菌株。

2.2 16S rDNA序列鑒定

擴增產物測序后用BLAST軟件進行比對分析，鑒定了13株乳酸菌屬于植物乳桿菌屬和腸球菌屬。35、34、33、25、26號菌株與植物乳桿菌RCM1相似性為100%，21、23、47號菌株與植物乳桿菌LB11相似性為100%，41、46號菌株與植物乳桿菌6.1相似性為100%，45號菌株與植物乳桿菌PKL20相似性為99.38%，31號菌株與殊異腸球菌S16B相似性為100%，32號菌株與鼠腸球菌ANP1相似性為100%(表1)。

表1 13株乳酸菌測序比對結果

2.3 具有抑菌活性乳酸菌的篩選結果

以大腸桿菌作為病原菌指示菌，通過牛津杯法對分離得到的13株菌進行抑菌試驗，由表2可知，13株菌對大腸桿菌都有抑菌活性，其中21、25、33、34、35號菌株的抑菌活性較強。

表2 13株乳酸菌對大腸桿菌的抑菌圈直徑

2.4 乳酸菌主要抑菌物質分析

由圖1可知，將上清液pH調整到7.0時，25、34號和鼠李糖乳桿菌GR-1菌株的上清液對大腸桿菌的抗菌活性均極顯著下降(P<0.01)；33號菌株上清液對大腸桿菌的抗菌活性顯著下降(P<0.05)；21、35號菌株上清液對大腸桿菌的抗菌活性均無顯著變化(P>0.05)。表明25、33、34號和鼠李糖乳桿菌GR-1菌株的主要抗菌物質包括有機酸。向上清液中加入蛋白酶K時，21、25、33、34號和鼠李糖乳桿菌GR-1菌株上清液對大腸桿菌的抗菌活性均極顯著下降(P<0.01)；35號菌株的上清液對大腸桿菌的抗菌活性顯著下降(P<0.05)。表明這5株菌株和鼠李糖乳桿菌GR-1的主要抗菌物質包括肽類及蛋白類物質。向上清液中加入過氧化氫酶時，21、33、35號和鼠李糖乳桿菌GR-1菌株上清液對大腸桿菌的抗菌活性均極顯著下降(P<0.01)；25、34號菌株的上清液對大腸桿菌的抗菌活性均顯著下降(P<0.05)。表明這5株菌株和鼠李糖乳桿菌GR-1的主要抗菌物質包括過氧化氫。

2.5 生長曲線

由圖2可知，5株乳酸菌在培養6 h后開始大量繁殖，進入對數生長期，14 h后趨于平緩，進入生長穩定期。35號菌株在10～12 h生長速度較慢，在12～14 h生長速度較快。21號菌株在6～10 h生長速度較慢，10～20 h生長速度較快，逐漸趨于穩定。5株乳酸菌對數生長期時間段為6～14 h，穩定生長期時間段為14～24 h。表明5株乳酸菌的生長性能均較好，菌體密度較高。

2.6 產酸能力曲線

由圖3可知，隨著培養時間的延長，5株乳酸菌培養液的pH也隨之降低，至培養16 h后21、25、33、34、35號菌株的pH分別降到4.07、3.74、3.77、3.87、3.74，并趨于穩定。表明5株乳酸菌均具有很強的產酸性能。

與對照相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)Compared with control,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01)；No *,No significant difference (P>0.05)圖1 不同條件下乳酸菌上清液對大腸桿菌抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of lactic acid bacteria supernatant against Escherichia coli under different conditions

圖2 乳酸菌生長曲線Fig.2 Growth curve of lactic acid bacteria

圖3 乳酸菌產酸曲線Fig.3 Acid production curve of lactic acid bacteria

2.7 乳酸菌藥物敏感性試驗

由表3可知，5株乳酸菌對氨芐西林、四環素、紅霉素等大多數抗菌藥敏感，但對環丙沙星、萬古霉素和卡那霉素完全耐藥，部分菌株對鏈霉素、利福平產生抗性。

表3 乳酸菌藥物敏感性

續表

3 討 論

獸醫工作者們越來越關注乳酸菌作為替抗產品治療奶牛疾病的新興領域，乳酸菌在多種病原菌引起的疾病的預防和治療中彰顯了巨大的潛力，其中就包括奶牛產后疾病[15-16]。乳酸菌作為奶牛生殖道內的常駐優勢菌群，可通過產生一些細菌素、酸性物質、過氧化氫等物質發揮益生效應。乳酸菌通過產生過氧化氫增強其殺菌能力[17]；產生的酸性物質能使生殖道內環境的pH降低，使生殖道內環境維持在一個較低的pH水平，抵御致病菌的入侵[18]；產生的細菌素類物質可殺死在生殖道內繁殖的致病菌，恢復機體健康。本研究采集健康奶牛生殖道分泌物，通過MRS培養基對其中的乳酸菌進行分離，得到5株具有抑制大腸桿菌活性的益生乳酸菌，經形態觀察和16S rDNA測序，確定得到的菌株均為乳酸菌，經鑒定為植物乳桿菌和腸球菌。說明從奶牛中分離得到的乳酸菌制成微生態制劑可更好更安全地作用于奶牛相關疾病的預防和治療。

抗菌藥物敏感性是評價益生菌安全性的重要指標之一[19-20]。本試驗分離的大多數菌株對氨芐西林、四環素、紅霉素、利福平、甲氧芐啶、氯霉素和青霉素7種抗菌藥物高度敏感，而所有分離菌株對環丙沙星、卡那霉素和萬古霉素完全耐藥。有研究表明乳酸菌對慶大霉素、卡那霉素等氨基糖苷類抗生素可能存在天然耐藥[19]，這也與高婧等[21]、黃曉棠[22]試驗結果一致。由于部分菌株對環丙沙星已產生抗性，因此在臨床上這些菌株可聯合抗菌藥共同使用，抗菌藥對耐藥性乳酸菌無毒害作用且能有效殺滅病原菌，使機體的微生態環境的優勢菌群為乳酸菌。但耐藥基因是否會轉移至其他乳酸菌或病原菌，導致乳酸菌作為益生菌使用可能存在潛在危險性，這仍需進一步驗證。左瑞雨等[23]研究結果表明，乳酸菌對不同抗生素的耐藥作用還會逐步加強。因此，在選擇制備微生態制劑的菌株時，可盡量選擇所帶抗藥因子少的益生菌。

此外，有研究表明植物乳桿菌對于某些病原菌具有抑制作用[24]，在本研究中也獲得了一致的結果，這也與尹珺伊等[25]、薛洋洋[26]試驗結果相一致。因此，植物乳桿菌作為益生菌制劑對于穩定陰道環境具有良好效果[27]。雖然腸球菌更多在腸道或糞便樣品中分離得到，然而其仍是健康女性陰道微生物的重要組成部分[28]，這也說明其在抑制致病菌過程中可能也發揮一定作用。

多項研究結果表明，陰道內的乳酸菌可通過黏附占位、維持菌群平衡、調節生殖道內的pH、產生細菌素來抑制生殖道內致病菌的生長繁殖從而維持生殖道健康。抑菌試驗結果表明，本研究分離的13株乳酸菌中，有5株乳酸菌對大腸桿菌抑菌活性較好。進一步通過抑菌活性試驗分析，結果表明，21和35號菌株的抗菌物質為過氧化氫和細菌素，而25、33、34號菌株的抗菌物質除了過氧化氫和細菌素以外還產生有機酸。吳惠貞等[29]對羅伊氏乳桿菌LYS-1發酵液的抑菌特性研究結果表明，其抑菌物質應為多種組分，可能由小分子肽、過氧化氫和有機酸組成，與本研究結果相一致。這些產物能通過酸化生殖道內微生態環境，抑制其他病原微生物的生長和繁殖，來維持生殖道微生態環境的穩定。

從生長曲線來看，25、33、34號菌株的對數生長期為6～12 h，35號菌株的對數生長期為6～14 h，21號菌株的對數生長期為8～20 h；從產酸曲線來看，分離的5株菌株其pH趨于穩定都只需16 h。這些特性保證了5株菌株進入生殖道內能迅速活化并大量繁殖，在生殖道內其生長規律適合繁殖和產生發酵代謝產物，保證了其在動物生殖道內產生益生作用的基礎。

根據上述結果可確定，益生菌能抑制大腸桿菌的繁殖，改善生殖道的菌群，但兩者之間的相關機制則還需進一步研究。本試驗結果也表明，利用分離自牛生殖道的菌株制成微生態制劑治療牛子宮內膜炎確實可行，為進一步開發微生態制劑奠定了基礎。但這些菌株在使用中的具體作用機理還需在體內試驗中進一步研究。

4 結 論

本研究分離得到的3株植物乳桿菌有望作為微生態制劑用于奶牛子宮內膜炎的臨床防治。作為微生態制劑的使用效果如何，還需開展動物體內安全性相關試驗進行確定。