“乳炎寧”水提物的抗炎作用研究

劉雨然，楊慧瑩，朱 妍，王蒙蒙，孫國結，張夢圓，王 燕，高嘉豪，連科迅，谷新利

(石河子大學動物科技學院，石河子 832003)

炎癥是機體對于體內外刺激的一種防御反應，臨床眼觀變化表現為紅、腫、熱、痛、機能障礙，當刺激較輕時，可產生局部炎癥，但當機體所受刺激較劇烈時，則可引起全身性的癥狀；從分子層面來講，炎癥的發生是由于體內外各種刺激激活機體炎性細胞,如白細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等，從而使其釋放炎性因子，并通過不同的方式使炎性因子到達相應細胞或組織誘發炎癥[1]。局部血管的滲出性反應是炎癥發生和發展的中心環節。局部組織或機體受到刺激后炎性細胞隨即產生大量的炎性因子，且大部分炎性因子都具有增加血管通透性的功能，局部血管的通透性增加，血液外滲到組織液當中，隨著組織液的增加組織腫脹、發熱，這就解釋了炎癥的臨床眼觀變化。適當的炎癥對機體是有利的反應，用于抵抗各種途徑的刺激從而保護機體避免更嚴重的損傷，但當炎性反應過于激烈時，則會產生細胞因子瀑布，大量的炎性因子與趨化因子產生，通過不同途徑作用于不同組織，從而發生急性或慢性炎癥。

本課題組前期已在臨床上證明由蒲公英、王不留行、紫花地丁、甘草等多種中藥組成的“乳炎寧”方劑水提物對治療奶牛乳房炎有明顯的效果[2]，但就其抗炎效果評價及抗炎機制并沒有作進一步研究。因此,本研究以本課題組前期研究為基礎，改良了“乳炎寧”水提物提取工藝，并以昆明小鼠為研究對象，通過二甲苯耳廓腫脹試驗、醋酸致毛細血管通透性試驗、角叉菜膠致足腫脹試驗、棉球致肉芽腫脹試驗及小鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)含量考察“乳炎寧”水提物的抗炎效果，以期為“乳炎寧”運用于臨床抗炎提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 7～9周齡、體重(20±2)g純種健康昆明小鼠，雌雄各半，由新疆醫科大實驗動物中心提供。

1.1.2 試驗藥物及試劑 試驗用“乳炎寧”組方中蒲公英、王不留行、紫花地丁等10種單味藥均購自石河子子午路大藥房；二甲苯購自天津永晟精細化工；醋酸購自天津市鑫鉑特化工有限公司；乙酰水楊酸(批號：C12509645)、角叉菜膠(批號：C12883549)和伊文思藍(批號：C12689437)均購自上海麥克林生化科技有限公司；生理鹽水購自國藥集團新疆制藥公司；脫脂棉購自石河子市潔曼衛生材料科技有限公司；小鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。試驗所用其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 RE52CS-2型旋轉蒸發儀購自上海亞榮生化儀器廠；精密電子天平購自北京賽多利斯公司；202型電熱恒溫干燥箱購自北京市永光明醫療儀器廠；1510型全波長酶標儀(序列號：1510-02980C)購自Thermo Fisher公司；HVA-85高壓蒸汽滅菌鍋購自華粵行儀器有限公司；ZG-280中藥煎藥包裝一體機購自吉首市中誠制藥機械廠。

1.2 方法

1.2.1 “乳炎寧”水提物的制備 “乳炎寧”水提物具體制備步驟如下：①取配伍好的“乳炎寧”方劑500 g，先置于電熱鼓風干燥箱55 ℃烘干后用10倍體積蒸餾水(5 L)浸泡2～3 h；②待藥液顏色明顯變化后用自動煎藥儀煎煮1.5 h，冷卻至室溫后盛出至容器中待用；③在第1次藥液盛出后，在藥渣中繼續加入8倍體積蒸餾水(4 L)繼續煎煮1.5 h；④將2次煎煮的藥液合并冷卻到室溫后用旋轉蒸發儀進行濃縮[3]。當水煎液體積濃縮至250 mL時，生藥濃度達到2 g/mL即可關閉裝置。按比例配制成高(1.6 g/mL)、中(0.8 g/mL)、低(0.4 g/mL)3個濃度梯度的“乳炎寧”水提物。

1.2.2 二甲苯致耳廓腫脹試驗 取生長環境一致且已預飼1周的健康小鼠60 只，雌雄各半，隨機分為5 組，分別為陰性對照組、陽性對照組(阿司匹林，0.2 g/kg)、“乳炎寧”水提物高劑量組(RYN-H組,16 mg/g)、“乳炎寧”水提物中劑量組(RYN-M 組,8 mg/g)、“乳炎寧”水提物低劑量組(RYN-L組,4 mg/g)，每組12只。“乳炎寧”水提物各組小鼠每天固定時間灌服各濃度的“乳炎寧”方劑，陽性對照組以10 μL/g的劑量灌服濃度為0.02 g/mL的阿斯匹林溶液，陰性對照組灌服等體積生理鹽水。連續給藥10 d，每天1次。在末次給藥2 h后，將0.02 mL二甲苯均勻涂抹于每只小鼠右耳前后，在致炎時間達到30 min后用頸椎脫臼法處死小鼠，用直徑6 mm的打耳器在小鼠左右耳相同位置打下耳片并稱量其重量。分別計算出各組的腫脹度及腫脹抑制率[4]。

腫脹度=致炎側耳片重量(右耳)-非致炎側耳片重量(左耳)

腫脹抑制率(%)=(對照組平均耳片腫脹度-試驗組耳片腫脹度)/對照組平均腫脹度×100%

1.2.3 醋酸致腹腔毛細血管通透性試驗 試驗分組及給藥方案同1.2.2。 采用小鼠腹腔染料滲出法測定醋酸對小鼠腹腔毛細血管的通透性。 末次給藥120 min后，各組小鼠注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，隨后立刻尾靜脈注射1%伊文思藍，劑量為0.1 mL/10 g。20 min后采用頸椎脫臼法處死小鼠，抽取5 mL蒸餾水反復沖洗腹腔并收集腹腔洗液。收集得到的腹腔洗液經3 000 r/min離心5 min后，取上清液用分光光度計測定其590 nm處吸光度值[5]。

1.2.4 角叉菜膠致足腫脹試驗 試驗分組及給藥方案同1.2.2。末次給藥60 min后，各組小鼠用規格為100 μL的微量進樣器從右足遠心端趾皮下進針注射30 μL 1%角叉菜膠溶液致炎，針頭沿著小鼠右足走中線進針，旋轉出針，以防止藥液帶出。致炎5 h后頸椎脫臼法處死小鼠，以踝關節骨為標志，將小鼠左右足剪下稱重[6]。

足腫脹度=小鼠右足重量-小鼠左足重量

足腫脹抑制率(%)=(陰性對照組平均足腫脹度-藥物處理組平均足腫脹度)/陰性對照組平均足腫脹度×100%

1.2.5 棉球致肉芽腫脹試驗 試驗前制作重量為(5±0.5)mg的脫脂棉球，裝入已滅菌的安瓿瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，隨后置于電熱鼓風干燥箱50 ℃烘干備用。取60 只健康昆明小鼠，雌雄各半，試驗分組及給藥方案同1.2.2。給藥前將小鼠稱重后全身消毒，用4%水合氯醛以0.1 mL/10 g 的劑量對小鼠進行腹腔注射，待小鼠麻醉后，用高壓滅菌的手術器械對小鼠進行棉球包埋手術，具體操作步驟如下：將小鼠仰臥保定，在其左側腋下約0.3 mm處做一小切口，把無菌棉球埋入小鼠腋下，確保棉球不會掉出后，將皮膚縫合，75%酒精消毒。手術完成后立刻對各組小鼠進行灌胃給藥。末次給藥1 h后將小鼠頸椎脫臼處死，按手術原切口取出之前包埋的棉球，將多余脂肪組織去除后，放入烘箱中60 ℃烘干致恒重。其重量減去棉球重量即為肉芽腫重量[7]。

1.2.6 小鼠血清中細胞因子TNF-α和IL-1β含量的測定 試驗分組及給藥方案同1.2.2。采用ELISA方法測定小鼠血清中細胞因子含量。末次給藥2 h后眼球采血1 mL于1.5 mL離心管中，靜置30 min后，3 500 r/min離心10 min，取上清液，ELISA法測定小鼠血清中 TNF-α和IL-1β含量，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3 統計分析

利用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，試驗結果除各項抑制率用百分數表示外，其余數據均用平均值±標準差表示；組間比較選用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。假定方差齊性用LSD檢驗，未假定方差齊性用鄧尼特T3檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 “乳炎寧”水提物對二甲苯致耳廓腫脹的影響

由表1可知，與陰性對照組相比，藥物處理組耳廓腫脹度均極顯著降低(P<0.01)，耳廓腫脹抑制率均升高，說明陽性對照組及“乳炎寧”水提物各劑量組均對二甲苯涂抹小鼠耳廓所致的急性炎癥有頡頏作用。與陽性對照組相比，“乳炎寧”水提物低劑量組耳廓腫脹度極顯著升高(P<0.01)，“乳炎寧”水提物中、高劑量組耳廓腫脹度差異不顯著(P>0.05)；“乳炎寧”水提物各劑量組相比，低劑量組與中劑量組耳廓腫脹度差異不顯著(P>0.05)，與高劑量組耳廓腫脹度差異極顯著(P<0.01)，中劑量組與高劑量組耳廓腫脹度差異不顯著(P>0.05)。腫脹抑制率隨著“乳炎寧”水提物劑量的增加而升高，有一定的劑量依賴性。

表1 “乳炎寧”水提物對二甲苯致耳廓腫脹的影響

2.2 “乳炎寧”水提物對醋酸致腹腔毛細血管通透性的影響

由表2可知，與陰性對照組相比，藥物處理組腹腔洗液吸光度均極顯著降低(P<0.01)，通透性抑制率均升高，說明陽性對照組與“乳炎寧”水提物各劑量組均能夠極顯著緩解由醋酸所致的腹腔毛細血管通透性增加；與陽性對照組相比，“乳炎寧”水提物低、中劑量組吸光度差異極顯著(P<0.01)，高劑量組吸光度差異顯著(P<0.05)；“乳炎寧”水提物各劑量組相比，低劑量組與中劑量組吸光度差異不顯著(P>0.05)，與高劑量組相比差異顯著(P<0.05)，中劑量組與高劑量相比差異不顯著(P>0.05)。 腹腔毛細血管通透性抑制率隨著“乳炎寧”水提物劑量的增加而升高，有一定的劑量依賴性。

表2 “乳炎寧”水提物對醋酸致腹腔毛細血管通透性的影響(D590 nm值)

2.3 “乳炎寧”水提物對角叉菜膠致足腫脹的影響

由表3可知，與陰性對照組相比，藥物處理組足腫脹度均極顯著降低(P<0.01)，足腫脹抑制率均升高，說明陽性對照組和“乳炎寧”水提物各劑量組均能有效抑制角叉菜膠致小鼠足腫脹的程度。與陽性對照組相比，“乳炎寧”水提物各劑量組足腫脹度均有極顯著差異(P<0.01)；“乳炎寧”水提物各劑量組相比，低劑量組與中劑量組差異不顯著(P>0.05)，但二者與高劑量組差異極顯著(P<0.01)。足腫脹抑制率隨著“乳炎寧”水提物劑量的增加而升高，有一定的劑量依賴性。

表3 “乳炎寧”水提物對角叉菜膠致足腫脹的影響

2.4 “乳炎寧”水提物對棉球致肉芽腫脹的影響

由表4可知，與陰性對照組相比，陽性對照組及“乳炎寧”水提物各劑量組的肉芽腫重量均極顯著降低(P<0.01)，說明阿司匹林和“乳炎寧”水提物各劑量組均能抑制因棉球所致的肉芽腫的重量；與陽性對照組相比，“乳炎寧”水提物低劑量組棉球肉芽腫重量極顯著增加(P<0.01)，中劑量組棉球肉芽腫重量顯著增加(P<0.05)，高劑量組棉球肉芽腫重量差異不顯著(P>0.05)；“乳炎寧”水提物各劑量組相比，低劑量組與中、高劑量組棉球肉芽腫重量差異極顯著(P<0.01)，中劑量組與高劑量組棉球肉芽腫重量差異顯著(P<0.05)。肉芽腫生成抑制率隨著“乳炎寧”水提物劑量的增加而升高，有一定的劑量依賴性。

2.5 “乳炎寧”水提物對小鼠血清中細胞因子TNF-α和IL-1β含量的影響

由圖1可知，與陰性對照組相比，陽性對照組和“乳炎寧”高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均極顯著降低(P<0.01)，“乳炎寧”水提物中劑量組血清中TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)，“乳炎寧”水提物低劑量組血清中TNF-α含量降低但差異不顯著(P>0.05)，IL-1β含量顯著降低(P<0.05)；與陽性對照組相比，“乳炎寧”低劑量組血清中TNF-α、IL-1β含量極顯著升高(P<0.01)，“乳炎寧”水提物中、高劑量組2種細胞因子含量差異不顯著(P>0.05)；“乳炎寧”水提物各劑量組相比，中、高劑量組血清中TNF-α和IL-1β含量差異不顯著(P>0.05)，低劑量組血清中TNF-α含量顯著高于中劑量組(P<0.05)，極顯著高于高劑量組(P<0.01)，IL-1β含量極顯著高于中、高劑量組(P<0.01)。

表4 “乳炎寧”水提物對棉球致肉芽腫脹的影響

①NC,陰性對照組；RYN-L,“乳炎寧”水提物低劑量組；RYN-M,“乳炎寧”水提物中劑量組；RYN-H,“乳炎寧”水提物高劑量組；ASP,陽性對照組。②肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)①NC,Negative control group;RYN-L,“Ruyanning” water extract low dose group;RYN-M,“Ruyanning” water extract medium dose group;RYN-H,“Ruyanning” water extract high dose group;ASP,Positive control group.②Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖1 “乳炎寧”水提物對小鼠血清TNF-α(A)和IL-1β(B)含量的影響Fig.1 Effects of ‘Ruyan Ning’ water extract on the contents of TNF-α (A) and IL-1β (B) in senum of mice

3 討 論

動物機體的炎癥實質上是損傷與抗損傷的一種病理過程，研究者根據炎癥發生后持續時間的長短將其分為急性炎癥和慢性炎癥。其中急性炎癥可對機體造成不可逆轉的損傷，這些損傷是由于炎性介質透過血管進入到組織中從而引起[8]。慢性炎癥則可能發生在急性炎癥之后，部分是由急性炎癥發展而來，慢性炎癥中的細胞因子相互作用，單核細胞趨化到炎癥部位，且巨噬細胞激活因子激活巨噬細胞。巨噬細胞長期且低量的分泌TNF-α、IL-1β等細胞因子，從而維持慢性炎癥的發展，且巨噬細胞的聚集趨化則可能導致肉芽腫的發生[9]。TNF-α是機體內主要的促炎因子并且會產生聯級反應促進T細胞IL-6、IL-1、IL-8的表達[10]。 TNF-α與IL-1β可反映出機體的炎性程度，因此,通過檢測機體TNF-α和IL-1β含量可反映機體的基本炎癥狀況[11]。炎癥動物模型的建立，是評價藥物抗炎性的必要步驟及中心環節[12]。本研究采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗、醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性試驗、角叉菜膠致小鼠足腫脹試驗及棉球致小鼠肉芽腫脹試驗探討“乳炎寧”水提物對急性和慢性炎癥的抗炎效果；通過檢測小鼠血清中細胞因子TNF-α和IL-1β的含量初步評價“乳炎寧”水提物對機體中主要致炎因子的影響。

奶牛急性乳腺炎中醫辨證分型為毒邪侵襲、肝氣郁結、乳汁蓄積、氣血兩虛、肝胃郁熱，急性乳腺炎是乳房部位發生急性化膿性感染的疾病，中醫稱之為乳癰，為解決血淤型的奶牛乳房炎，本課題組通過多年臨床經驗及相關研究將蒲公英、王不留行、紫花地丁等中草藥按照一定比例配伍而成，且在臨床試驗上對奶牛乳房炎有很好的療效[13]。董奎龍等[14]曾報道，通過對患有急性乳房炎的奶牛灌服含有蒲公英、紫花地丁等中藥的組方有顯著的抗炎及治療效果，并且其效果與抗生素相當。蔣威等[15]在對蒲鹿乳炎散的鎮痛抗炎研究中發現，其水煎醇沉液對小鼠二甲苯致耳廓腫脹、醋酸致毛細血管通透性、角叉菜膠致小鼠足腫脹有明顯的抑制作用。其試驗結果與本試驗一致，但因其組方藥的活性成分提取方式與本試驗有所差異，所以對本試驗組方“乳炎寧”不同提取方式的抗炎效果還有待進一步考量。李林育[16]對英黃散水煎液進行了一系列抗炎試驗，并通過急性及慢性炎癥模型證明了英黃散水煎液有很好的抗炎作用，對慢性炎癥的研究發現，棉球肉芽腫抑制效果與英黃散劑量并沒有線性關系，但本研究結果顯示，肉芽腫抑制效果與“乳炎寧”水提物劑量呈正比線性相關，可能與2個組方中臣藥及佐使藥物的種類及劑量不同導致，具體原因需進一步研究。趙自冰[17]在小鼠炎癥模型上對公英散注射液的藥理學評價結果表明，公英散注射液高(8 g/kg)、中(4 g/kg)劑量對小鼠二甲苯致耳廓腫脹、醋酸致毛細血管通透性及棉球致肉芽腫均有明顯的抑制作用，且公英散注射液能顯著降低小鼠血清中細胞因子TNF-α的含量，其試驗結果與本試驗“乳炎寧”水提物降低小鼠血清中TNF-α的結果一致，但就其效果看本試驗結果稍遜色，一方面可能是由于2個組方的配伍比例有所不同，另一方面也可能是由于用藥方式不同所致，通過直接腹腔注射可有效避免因首過效應而導致的藥效喪失，因此將“乳炎寧”水提物制備成注射液是否可達到更好的效果還有待進一步研究。劉濤等[18]研究發現，乳炎康注射液對小鼠二甲苯致炎模型有顯著抑制作用，其結果與本試驗研究結果一致。以上4種治療奶牛乳房炎的組方與本試驗研究對象“乳炎寧”均含蒲公英，紫花地丁等中藥成分且在臨床試驗已證明對治療奶牛乳房炎有很好的效果，且其抗炎效果研究結果與本試驗一致。乳黃消選用知母和丹參作為君藥，白東東等[19]在對乳黃消口服液消腫止痛功效的研究中發現，乳黃消口服液對小鼠的急性、慢性炎癥有突出的治療效果，而本試驗中研究的中成藥“乳炎寧”以蒲公英、紫花地丁、王不留行作為君藥，就抗炎效果上2種組方都顯示出極好的效果。包金榮等[5]對以訶子、黃柏、梔子、大黃4 種蒙藥組成的治療奶牛乳房炎的蒙藥復方進行抗炎作用研究，結果表明這種蒙藥復方對二甲苯致小鼠耳廓腫脹、小鼠棉球肉芽腫及醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性均有顯著的抑制作用，與本試驗結果相似，都顯示出了良好的抗炎效果。弓素梅等[20]對主要成分為金銀花、黃芪的組方藥乳炎消進行抗炎效果評價，結果顯示，乳炎消口服液對乳房炎奶牛血清中TNF-α、IL-1β等細胞因子有顯著的抑制作用，本試驗結果與其結果趨勢一致。雖然以上3種治療奶牛乳房炎的組方與“乳炎寧”組方的配伍不同，但其試驗結果與本試驗結果相似且都表現出顯著的抗炎效果。“乳炎寧”組方以中醫理論為基礎，按照君臣佐使配伍原則，將蒲公英、王不留行、紫花地丁、甘草等多種中草藥按一定比例進行配伍，各種中藥相互補益，更符合中國傳統中藥的運用規律，更接近臨床運用。

Ma等[21]發現，蒲公英甾醇為蒲公英水提物的主要成分，且可顯著降低小鼠血清細胞因子TNF-α、IL-β的含量；董長穎等[22]通過通過建立小鼠急性炎癥模型證明蒲公英甾醇具有優良的抗炎性能；黨曉芬[23]發現，炒王不留行水提物可顯著降低小鼠血清中炎癥相關因子TNF-α的含量，通過抑制炎性因子的升高來減輕炎癥的發生與發展；“乳炎寧”組方藥中以王不留行作為君藥且以同樣的方式得到水提物，提示“乳炎寧”的抗炎作用可能與抑制血清中TNF-α有關。張靜等[24-25]通過二甲苯致耳廓腫脹試驗、醋酸致腹腔毛細血管通透試驗及炎性足跖抑制性試驗證明紫花地丁水提物具有一定抗炎效果；李艷麗等[26]同樣對紫花地丁水提物進行了研究，并通過二甲苯致足腫脹試驗、蛋清致小鼠足腫脹試驗證明了紫花地丁水提物具有優良的抗炎效果。以上試驗均與“乳炎寧”相關，且試驗結果與本研究結果一致。

本試驗結果表明，“乳炎寧”水提物各劑量組對小鼠急性和慢性炎癥模型有很好的抑制作用，呈劑量依賴性，且在慢性炎癥模型中，“乳炎寧”高劑量組與陽性對照組效果相當。“乳炎寧”水提物中、高劑量組均可降低小鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量，低劑量組血清中TNF-α與陰性對照組無明顯差異，IL-1β顯著降低，提示“乳炎寧”水提物不僅不會引起體內炎癥，且可能會起到預防炎癥發生的效果。表明“乳炎寧”水提物有較好的抗炎效果，但為了更好地闡明其抗炎機理，“乳炎寧”水提物的抗炎活性成分及抗炎作用機制需進一步研究。

4 結 論

本研究發現“乳炎寧”水提物各劑量組對二甲苯致耳廓腫脹、醋酸致腹腔毛細血管通透性、角叉菜膠致足腫脹、棉球致肉芽腫脹的影響均有統計學差異，其中“乳炎寧”水提物高劑量組效果最好；高劑量組對小鼠血清細胞因子TNF-α和IL-1β有極顯著的抑制作用。本研究結果表明“乳炎寧”水提物具有良好的抗炎效果，為“乳炎寧”的臨床運用及進一步研究提供了理論依據。