MLKL基因敲除對豬偽狂犬病病毒復制的影響

謝思豪，勾紅潮，卞志標，李 斌，蔡汝健，臧瑩安，李春玲

(1.仲愷農業工程學院，廣州 510225；2.廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州 510640；3.廣州市從化區動物衛生監督所，廣州 510900)

CRISPR/Cas9基因編輯技術是一種簡單、可靠的基因組編輯工具[1-2]，只需針對目的基因序列設計特異性的sgRNA，通過sgRNA對目的基因核苷酸序列進行識別定位，引導Cas9蛋白特應性結合并發揮核酸內切酶活性，造成特定位點上DNA雙鏈損傷，其在修復的過程中可實現基因組特定位點的DNA缺失、插入或堿基突變[3]。目前，CRISPR/Cas9基因編輯技術已廣泛用于各種細胞的基因編輯和修飾，為疫苗生產過程中提高病毒產量提供了一種可行性策略。張爽等[4]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了干擾素調節因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)基因敲除PK-15細胞系，與對照細胞相比，敲除IRF3基因顯著增加了豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)拷貝數。張越秀等[5]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了敲除2’,5’寡腺苷酸合成酶2(OAS2)基因的豬腎上皮細胞(porcine kidney epithelial cells,PK-15)，將豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)感染PK-OAS2-KO細胞系，結果顯示敲除OAS2基因能夠顯著促進CSFV復制。

PRV屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，具有143 kb的雙鏈線性DNA，編碼70多種蛋白質[6]。PRV的自然宿主是豬，但它可以感染大多數哺乳動物，包括豬、牛、馬、嚙齒動物和犬，對養殖業危害巨大[7-8]。 近年來人感染PRV的情況多有發生[9]。 PRV在豬外周神經系統的三叉神經節中可建立終身潛伏感染[10]。在某些情況下，PRV可重新激活，繼而導致PRV在豬場的反復流行，難以控制和根除。目前，豬偽狂犬病的防控以疫苗接種為重要手段，其中以PRV Bartha-K61為代表[11]。因此，提高PRV Bartha-K61病毒產量對疫苗生產具有重要意義。

程序性細胞死亡是哺乳動物宿主防御病原感染的重要途徑，壞死作為程序性細胞死亡的一種炎癥形式，在對抗病毒感染中起著重要作用[12]。壞死的激活依賴于受體相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)和混合譜系激酶結構域樣(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)的信號級聯反應[13-14]。MLKL是RIPK3的功能底物，即在細胞壞死中被RIPK3激活的下游蛋白[15]。在MLKL磷酸化被激活后形成寡聚體，這些寡聚體被轉移到細胞質和細胞內膜上，導致細胞壞死[16-17]。前期研究表明，穩定敲低RIPK3或MLKL基因表達可以減少PRV GD-WH野毒變異株誘導的細胞壞死，并可以提高PRV GD-WH野毒變異株病毒滴度[18]。為了構建可促進PRV Bartha-K61增殖的細胞株，在前期研究基礎上，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對PK-15細胞MLKL基因對應的染色體序列進行雙sgRNA剪切，通過單克隆純化獲得MLKL基因缺失的PK-15細胞株(PK-15 MLKL-KO)，以期為提高PRV Bartha-K61等疫苗株的培養滴度提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒與質粒

PK-15細胞、PRV GD-WH株(PRV GD-WH)、PRV Bartha-K61疫苗株(PRV Bartha-K61)均由廣東省農業科學院動物衛生研究所豬病研究室保存；大腸桿菌Trans10感受態細胞購自全式金生物技術有限公司；CRISPR/Cas9載體質粒pX459 pSpCas9-2Apuro-MCS和輔助載體質粒EZ-GuideXH均購自Addgene公司。

1.2 主要試劑

限制性核酸內切酶BbsⅠ、Hind Ⅲ、XhoⅠ均購自New England Biolabs公司；T4 DNA Ligase、T4 DNA Ligase Buffer均購自TaKaRa公司；Lipofectamine 3000轉染試劑購自Thermo Fisher Scientific公司；碘化丙啶(PI)溶液購自Beyotime Biotechnology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG多克隆抗體、HRP標記的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體、兔抗MLKL多克隆抗體、小鼠抗GAPH單克隆抗體均購自Beyotime Biotechnology公司。

1.3 引物設計及合成

根據NCBI數據庫公布的豬MLKL基因序列(Gene ID:100736836)，通過在線CRISPR設計工具(http:∥crispr.mit.edu/)設計2對特異性sgRNA序列(表1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 MLKL基因sgRNA序列

1.4 MLKL-sgRNA載體構建

將合成后的單鏈sgRNA退火形成雙鏈，分別與經BbsⅠ酶切的CRISPR/Cas9載體pX459 pSpCas9-2A-puro-MCS和輔助載體EZ-GuideXH通過T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜，獲得pX459-sgRNA1和EZ-sgRNA2重組質粒并測序鑒定。以Hind Ⅲ和XhoⅠ對獲得的2個重組質粒進行雙酶切，回收后將線性化酶切產物16 ℃連接過夜，轉化大腸桿菌Trans10感受態細胞，通過氨芐抗性平板篩選挑取單克隆，進行菌落PCR篩選，將篩選到的陽性克隆質粒進一步測序驗證。

1.5 PK-15細胞培養與轉染

將PK-15細胞培養于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。轉染前將生長狀態良好的PK-15細胞接種至6孔板中培養，當細胞匯合度達到70%～80%時，按照Lipofectamine 3000轉染試劑說明書將5 μg MLKL-sgRNA載體轉染至PK-15細胞中。

1.6 敲除MLKL基因的單克隆細胞株篩選

細胞轉染24 h后，更換含有0.70 μg/mL嘌呤霉素的10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中進行藥物篩選，連續篩選5 d，觀察到陰性對照組細胞全部死亡后，將得到的陽性細胞繼續培養1周后消化成單個細胞，使用有限稀釋法將藥物篩選得到的陽性細胞稀釋至96孔板中繼續培養，約2周后挑選生長狀態良好的單克隆細胞進行鑒定。

1.7 MLKL基因敲除PK-15細胞株的鑒定

從96孔板中挑選生長狀態良好的單克隆細胞進行擴大培養，連續傳代到P10代后通過PCR、測序和Western blotting對MLKL基因的穩定敲除效果進行鑒定。取部分細胞提取DNA，使用針對敲除靶點設計的特異性引物進行PCR擴增，引物序列為：F：5′-GCCATCTCTTACCTCCCCTGA-3′；R：5′-AAACTAAGGCTGGAAGGGAGCA-3′，退火溫度58 ℃，預計擴增片段長度為1 149 bp。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，檢測堿基插入或者缺失情況。通過Western blotting檢測MLKL蛋白的表達，篩選MLKL基因敲除的PK-15 MLKL-KO細胞株。

1.8 病毒滴度測定

將PK-15和PK-15 MLKL-KO細胞接種在6孔板中，待細胞匯合度至70%～80%時，以MOI=10的PRV GD-WH和PRV Bartha-K61分別感染PK-15和PK-15 MLKL-KO細胞，并置于37 ℃、5% CO2培養箱吸附1 h。吸附結束后棄去接種物，用PBS清洗細胞3次，更換為維持培養基進行培養。按照12、24及36 h不同時間點收取細胞上清病毒液，將病毒液反復凍融3次，離心取上清液，將上清液分別10倍遞減梯度稀釋，感染96孔板中的PK-15細胞，病毒感染后共觀察4 d，記錄各孔的病變情況，按照Reed-Muench法測定各上清液的病毒滴度。

1.9 細胞壞死測定

將PK-15和PK-15 MLKL-KO細胞接種在96孔板中，待細胞匯合度至70%～80%時，以MOI=10的PRV GD-WH和PRV Bartha-K61分別感染PK-15和PK-15 MLKL-KO細胞，36 h后棄細胞培養基，用PI溶液在4 ℃下染色10 min，于熒光顯微鏡下觀察細胞的PI染色情況。

1.10 統計學分析

所有試驗至少重復3次，使用GraphPad Prism 6.0軟件進行數據分析，結果以平均值±標準差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 重組質粒MLKL-sgRNA構建

pX459-sgRNA1和EZ-sgRNA2重組質粒經Hind Ⅲ和XhoⅠ雙酶切(圖1A)，酶切產物連接、轉化，將篩選到的陽性克隆質粒進一步測序驗證，測序結果表明MLKL-sgRNA載體構建成功(圖1B)。

2.2 MLKL基因敲除PK-15單克隆細胞系構建

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，出現1 149和502 bp 2條條帶(圖2A)；對2條條帶進行回收、純化和測序，序列比對分析結果顯示，PK-15 MLKL-KO細胞在sgRNA靶點處缺失647 bp(圖2B)。通過Western blotting對PK-15 MLKL-KO細胞中MLKL基因敲除效果進一步鑒定，結果顯示，PK-15 MLKL-KO細胞未檢測到MLKL蛋白的表達(圖2C)。表明本試驗成功構建了MLKL基因敲除的PK-15 MLKL-KO細胞株。

2.3 MLKL基因敲除對PRV GD-WH和PRV Bartha-K61病毒滴度的影響

由圖3A可知，感染后12～24 h，PRV GD-WH在PK-15 MLKL-KO細胞中的病毒滴度極顯著或顯著高于PK-15細胞(P<0.01；P<0.05)；感染后36 h，PRV GD-WH在PK-15和PK-15 MLKL-KO細胞中的病毒滴度無顯著差異(P>0.05)。由圖3B可知，感染后12～36 h，PRV Bartha-K61在PK-15 MLKL-KO細胞中的病毒滴度極顯著高于PK-15細胞(P<0.01)，其中，PRV Bartha-K61感染PK-15和PK-15 MLKL-KO細胞24 h后，病毒滴度分別為105.1和106.3TCID50/mL，提高了約15.8倍；在感染36 h后，病毒滴度分別為105.9和106.9TCID50/mL，提高了10倍。

2.4 MLKL基因敲除對PRV GD-WH和PRV Bartha-K61誘導細胞壞死的影響

PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15和PK-15 MLKL-KO細胞后，于熒光顯微鏡下觀察細胞的PI染色(紅色熒光)的情況，結果顯示，PK-15 MLKL-KO細胞感染組PI陽性細胞明顯少于PK-15細胞感染組(圖4)。

①A，pX459-sgRNA1和EZ-sgRNA2重組質粒雙酶切產物；B，MLKL-sgRNA測序結果。②M，DL5000 DNA Marker；1，EZ-sgRNA2；2，pX459-sgRNA1①A，Double digestion products of pX459-sgRNA1 and EZ-sgRNA2 recombinant plasmids；B,Sequencing results of MLKL-sgRNA.②M，DL5000 DNA Marker;1，EZ-sgRNA2;2，pX459-sgRNA1圖1 MLKL基因敲除重組質粒的構建Fig.1 Construction of MLKL gene knockout recombinant plasmid

①A，MLKL基因敲除PK-15細胞PCR鑒定；B，敲除MLKL基因的PK-15細胞測序結果；C,PK-15細胞中MLKL蛋白的表達。②M，DL2000 DNA Marker；1，PK-15細胞；2，PK-15 MLKL-KO細胞①A,PCR identification of MLKL gene knockout PK-15 cell;B,Sequencing results of MLKL gene knockout PK-15 cell;C,Expression of MLKL protein in PK-15 cell.②M,DL2000 DNA Marker;1,PK-15 cell;2,PK-15 MLKL-KO cell圖2 敲除MLKL基因的PK-15 細胞鑒定結果Fig.2 Identification results of PK-15 cells with MLKL gene knockout

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；ns，差異不顯著(P>0.05)*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);ns,No significant difference (P>0.05)圖3 不同感染時間PRV GD-WH(A)和PRV Bartha-K61(B)病毒滴度Fig.3 Virus titer of PRV GD-WH (A) and PRV Bartha-K61 (B) at different infection time

圖4 MLKL基因敲除對PRV GD-WH和PRV Bartha-K61誘導細胞壞死的影響(200×)Fig.4 Effects of MLKL gene knockout on PRV GD-WH and PRV Bartha-K61 induced cell necrosis (200×)

3 討 論

CRISPR/Cas9基因編輯技術是近年來新發展起來的新型基因編輯技術，相較于與之前的ZFNs和TALENs基因編輯技術，CRISPR/Cas9基因編輯技術僅需要設計特異性sgRNA便可以對特定基因位點進行修飾，極大地降低應用成本、縮短時間[19]。同時，CRISPR/Cas9基因編輯技術具有特異性高、脫靶率低且可以同時對多個位點進行編輯的優勢。為了提高編輯的成功率，本研究使用了雙sgRNA編輯系統，經鑒定建立的PK-15 MLKL-KO細胞株成功敲除了MLKL基因647 bp，Western blotting也未檢測到MLKL蛋白表達。

在減毒活疫苗的生產過程中，提高病毒滴度是關鍵。CRISPR/Cas9介導的RNaseL敲除促進了PRV Bartha-K61疫苗株的復制[20]。為了提高Vero細胞中輪狀病毒疫苗的低產量，研究者采用CRISPR/Cas9技術編輯了Vero細胞的NUE2、NAT9、COQ9、EMX2等基因，使輪狀病毒疫苗的產量顯著增加[21-23]。程序性細胞壞死是一種重要的宿主防御機制，通過誘導細胞死亡限制病毒增殖，在對抗病毒感染中起著重要作用。MLKL是程序性細胞壞死的關鍵執行者，脂多糖(LPS)、病毒核酸和干擾素等均可誘導MLKL所介導的細胞壞死[24-26]。本研究擬構建一個穩定敲除MLKL基因的PK-15細胞株，用于PRV Bartha-K61疫苗生產過程中提高病毒滴度，結果表明，敲除MLKL基因顯著提高了PRV Bartha-K61的復制能力。與PK-15細胞相比，PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO細胞24 h后，病毒滴度提高了約15.8倍；在感染36 h后，病毒滴度提高了10倍。此外，穩定敲除PK-15細胞MLKL基因可以提高PRV GD-WH病毒滴度，這與Gou等[18]研究結果一致。

程序性細胞壞死是重要的抗病毒宿主的防御，其通過防止受感染細胞成為病毒工廠來限制病毒的傳播。 研究表明，Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)[27]、牛痘病毒(VV)[28]、寨卡病毒(ZIKV)[29]、甲型流感病毒(IAV)[30]均能誘導程序性細胞壞死的發生。多種病毒感染模式的例子強調了程序性細胞壞死對宿主免疫的重要性。MLKL基因缺失促進了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61在PK-15細胞中的復制，與PK-15細胞相比，PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO細胞后，壞死細胞明顯減少。PK-15 MLKL-KO細胞對PRV Bartha-K61增殖的促進作用可能與程序性壞死通路的抑制和細胞活性的增加有關，而MLKL缺失細胞株可能有潛力用于生產其他病毒的減毒疫苗，但敲除MLKL基因影響PRV Bartha-K61增殖的分子機制仍需進一步深入研究。

4 結 論

本研究構建了MLKL基因敲除的PK-15細胞株，與PK-15細胞相比，PK-15 MLKL-KO細胞顯著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的復制和存活能力，PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO細胞后，壞死細胞明顯減少。