綿羊肺炎支原體P6058aa-928aa蛋白的原核表達及間接ELISA方法的建立

田廣原,王宇琛,周雅坪,郭 婷,趙紅梅,趙逢淼,孫雅婕,卞宇晨,于佳梁,周雨霞

(內蒙古農業大學，獸醫微生物學與免疫學實驗室，呼和浩特 010018)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)是引起綿羊和山羊呼吸道疾病的重要病原體之一[1]。支原體感染所引起的疾病在養殖業中危害范圍較廣[2]，通常情況下動物以慢性、潛伏性感染為主，并與其他病原微生物共同感染[3]。內蒙古地區是中國主要的養羊區，隨著養殖業逐漸規模化，養殖密度也隨之增加，使得該病原在密集的群體中更加容易擴散。

目前檢測綿羊肺炎支原體的方法有血清學方法、病原分離法、PCR、生長抑制試驗等。病原分離法是檢測綿羊肺炎支原體的金標準，但其培養條件較為苛刻。鑒于綿羊肺炎支原體的高患病率，開展一種血清學診斷靶標的探索對于該病的防控具有重要意義[4]。ELISA具有靈敏度高、特異性好、易于牧場工作人員操作和批量化檢測等諸多優點，已成為臨床中綿羊肺炎支原體檢測的常用方法[5]。

近年來，關于綿羊肺炎支原體保護性抗原的研究很多，黃海碧[6]針對綿羊肺炎支原體NM2010株全基因組的測序及基因功能結果注釋分析，篩選得到多個綿羊肺炎支原體表面脂蛋白；徐春光等[7]對綿羊肺炎支原體NM2010株篩選后得到其表面脂蛋白P60，并驗證了P60蛋白是一種主要保護性抗原且具有良好的反應原性。基于此，本試驗將P60基因進行截短表達，并以Western blotting方法驗證其反應原性，將P60截短蛋白作為診斷抗原，建立檢測綿羊肺炎支原體抗體的間接ELISA方法，為綿羊肺炎支原體血清抗體檢測提供一種可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

綿羊肺炎支原體NM2010株及pET-32a(+)質粒、口蹄疫病毒陽性血清、小反芻獸疫病毒陽性血清、布氏桿菌陽性血清、牛支原體陽性血清、絲狀支原體山羊亞種陽性血清均由本實驗室保存，臨床血清樣本于內蒙古呼和浩特市周邊某羊場采集。

支原體基因組提取試劑盒購自Axygen公司；牛血清白蛋白(BSA)、質粒小提試劑盒、柱式膠回收試劑盒、大腸桿菌Trans-T1感受態細胞、大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞均購自北京全式金生物科技有限公司；IPTG購自北京索萊寶生物科技有限公司；T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；驢抗綿羊IgG-HRP、鎳層析柱BCA蛋白定量試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；綿羊肺炎支原體標準陽性血清、陰性血清及綿羊肺炎支原體間接血凝試劑盒均購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。

1.2 P60蛋白抗原表位區預測及載體構建

以綿羊肺炎支原體NM2010株(登錄號：AG35_RS03295)基因組DNA為模板，利用DNAStar軟件中的Protean對P60蛋白的抗原區、親水區進行分析，篩選主要抗原域。通過Primer Premier 5.0軟件設計1對擴增P60截短基因的特異性引物，上、下游引物分別為：5′-CGGGGTACCTCTGAAAGGT-TTGATGAAGATCGAA-3′和5′-CCGCTCGAG-TTGAATTCTAAGATCGTTAAATTGG-3′(下劃線處分別為KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。對PCR產物及pET-32a(+)質粒用限制性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ同時進行雙酶切。然后用T4 DNA連接酶將目的片段和表達載體pET-32a(+)在16 ℃連接12 h。將連接產物轉Trans1-T1大腸桿菌感受態細胞，通過菌落PCR篩選出陽性菌落后提取重組質粒，并由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.3 重組蛋白最佳誘導時間的優化

將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，培養至菌液D600 nm值為0.6～0.8時，分裝至6個試管中，每管5 mL，并編號，然后向每管中加入終濃度1 mmol/L的IPTG，37 ℃分別誘導2、4、6、8、10及12 h，經SDS-PAGE篩選出最佳誘導時間。

1.4 重組蛋白的表達形式及純化鑒定

根據最佳誘導時間對重組菌株進行大量培養，待菌液D600 nm的值為0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG在37 ℃進行誘導表達，收集菌體，用預冷的PBS洗滌3次，置于冰上進行超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，分別收集上清液和沉淀，經SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達形式。

根據上述操作對重組菌株進行誘導表達后收集菌體，超聲破碎后以12 000 r/min離心20 min收集菌體沉淀，經變性、復性后用濾器過濾除雜質，經His-Ni柱親和層析進行純化，采用梯度濃度洗脫方法，向Ni柱中加入2倍柱體積洗滌緩沖液，清洗3次；將過濾后的蛋白液加到Ni柱中，置于4 ℃結合2 h，棄管中液體；再用2倍柱體積的洗滌緩沖液沖洗Ni柱3次，洗脫雜蛋白；最后向Ni柱中加入2倍柱體積的結合緩沖液，洗脫目的蛋白。取40 μL純化后的蛋白與10 μL SDS-PAGE Buffer混勻，沸水浴10 min后冰上靜置2 min，上樣10 μL，經SDS-PAGE鑒定重組蛋白的純化結果。采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定。

1.5 表達產物的Western blotting檢測

以綿羊支原體陽性血清為一抗，驢抗綿羊IgG-HRP為二抗，將純化后得到的P60截短蛋白經SDS-PAGE后，轉至0.45 μm的NC膜上，隨后加入5%脫脂乳于4 ℃封閉12 h，封閉結束后用TBST洗滌5次，加入稀釋好的陽性血清，37 ℃孵育2 h，再次洗滌5次后加入酶標二抗，37 ℃孵育2 h，洗滌5次后加入顯色液，顯色結束后觀察結果，進行Western blotting檢測，檢驗表達產物的反應原性。

1.6 間接ELISA方法的建立

1.6.1 重組抗原的最佳包被濃度以及一抗血清最佳稀釋濃度確定 通過篩選將純化后的P60截短蛋白經包被液稀釋至4、2、1、0.5 μg/mL后，以每孔100 μL包被至酶標板中，用3% BSA進行封閉；PBST洗滌3次后將綿羊肺炎支原體陽性及陰性血清均以1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋，每孔100 μL，用PBST洗滌3次。將驢抗綿羊IgG-HRP二抗用稀釋液1∶4 000稀釋，每孔加100 μL。37 ℃孵育1 h，洗滌后每孔加入100 μL TMB顯色液，室溫避光顯色10 min，立刻向每孔中加入50 μL的終止液(2 mol/L H2SO4)終止反應。用PBS做為空白對照。用酶標儀測定D450 nm值，并計算陽性血清與陰性血清吸光值的比(P/N)，選取D450 nm值接近1且P/N值最大的一組數值所對應的條件，即為篩選出的最佳抗原包被量和一抗稀釋濃度。

1.6.2 一抗最佳孵育時間的確定 按照上述優化后的條件進行一抗孵育時間的篩選，分別選擇孵育0.5、1、1.5、2 h。比較各組D450 nm的值，篩選出一抗最佳孵育時間。

1.6.3 酶標二抗最佳工作濃度的確定 按照上述優化的條件進行酶標二抗的最佳工作濃度篩選，利用稀釋液將酶標二抗按1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000進行稀釋，測定D450 nm值，確定二抗最佳工作濃度。

1.7 間接ELISA方法的驗證

1.7.2 特異性試驗 按照上述建立的ELISA方法，分別檢測口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒、布氏桿菌、牛支原體、絲狀支原體山羊亞種的陽性血清，每種血清做3個重復，用綿羊肺炎支原體陰性和陽性血清作為陰性對照和陽性對照，并以PBS作為空白對照。

1.7.3 敏感性試驗 將綿羊肺炎支原體標準陽性血清進行2倍倍比稀釋，從1∶32稀釋至1∶4 096，并以綿羊肺炎支原體陰性血清作為陰性對照。利用上述建立的ELISA方法進行檢測，以P/N值及陰陽性臨界值為依據，判定該方法的敏感性。

1.7.4 重復性試驗 批內重復試驗：以同一批次的蛋白包被酶標板，隨機取5份血清，每個血清做5個重復，計算變異系數，評價批內重復性；以5個不同批次包被的酶標板對5份血清進行檢測，每個血清做5個重復，變異系數(%)=(標準差÷平均值)×100%，計算變異系數，評價批間重復性。

1.7.5 臨床樣品的檢測 分別使用本試驗建立的基于P60截短蛋白的間接ELISA方法和綿羊肺炎支原體間接血凝診斷試劑盒對從內蒙古某羊場采集的92份臨床血清樣品進行檢測，計算二者的符合率。

2 結 果

2.1 P60蛋白抗原表位區預測及載體構建

在GenBank中下載P60基因序列的CDS區域，用生物信息學軟件篩選出P60基因在58-928位氨基酸區域親水指數為0～2.0、抗原指數為0.8～1.7(圖1)。根據本實驗室已完成的針對綿羊肺炎支原體NM2010株全基因組測序工作及基因功能注釋結果分析，篩選得到一個綿羊肺炎支原體黏附素樣蛋白P60，利用NCBI BLAST對P60基因進行氨基酸序列相似性對比，分析結果顯示，綿羊肺炎支原體P60基因序列與綿羊肺炎支原體NCTC10151株的相似性為99.92%，證明該基因在綿羊肺炎支原體中具有較高的保守性。經PCR反應擴增后得到P6058aa-928aa基因，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小約870 bp(圖2)。 將目的基因連接到pET-32a(+)載體中，經測序重組表達載體與預期一致。

2.2 重組蛋白最佳誘導時間的優化

SDS-PAGE結果顯示，經IPTG誘導的重組蛋白均可在大腸桿菌原核表達系統中表達，其蛋白分子質量約為42 ku(圖3)，均與預測分子質量相符。隨著誘導時間的增加，蛋白的表達量也逐漸增大；當誘導10 h后，蛋白表達量基本保持不變，最佳誘導時間為10 h。

2.3 重組蛋白的表達形式及純化鑒定

將誘導后pET-32a-P6058aa-928aa破碎，對上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE，對表達產物進行可溶性分析，結果表明，該蛋白在沉淀中出現，說明重組蛋白以包涵體的形式表達(圖4A)；將包涵體進行變性、復性后再進行Ni柱親和層析純化和SDS-PAGE鑒定，在42 ku處出現目的條帶，未見其他雜蛋白(圖4B)，表明成功獲得純度較高的P60蛋白。BCA蛋白定量測得蛋白濃度為0.795 mg/mL。

圖1 綿羊肺炎支原體P60蛋白主要抗原域分析結果Fig.1 Analysis of major antigenic domains of Mycoplasma ovipneumoniae P60 protein

M,Trans 2K DNA Marker；1、2，綿羊肺炎支原體NM2010株 gDNA；3，陰性對照M,Trans 2K DNA Marker;1 and 2,Mycoplasma ovipneumoniae NM2010 gDNA strain;3,Negative control圖2 綿羊肺炎支原體P6058aa-928aa基因片段PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of Mycoplasma ovipneumoniae P6058aa-928aa gene

M,蛋白質分子質量標準；1～6,誘導2、4、6、8、10、12 h的重組蛋白M,Protein Marker;1-6,Recombinant protein induced for 2,4,6,8,10 and 12 h,respectively圖3 重組蛋白不同誘導時間的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein induced for different time

M，蛋白質分子質量標準；1，pET-32a空載體；2，pET-32a-P6058aa-928aa 37 ℃誘導10 h破碎后上清液；3，pET-32a-P6058aa-928aa37 ℃誘導10 h破碎后沉淀；4，純化的P60重組蛋白M, Protein Marker; 1, pET-32a empty carrier; 2, Supernatant of induced pET-32a-P6058aa-928aa at 37 ℃ for 10 h; 3, Precipitate of induced pET-32a-P6058aa-928aa at 37 ℃ for 10 h; 4,Purified recombinant protein P60圖4 P60重組蛋白的表達(A)及純化(B)鑒定Fig.4 Expression (A) and purification (B) identification of recombinant protein P60

2.4 表達產物的Western blotting分析

Western blotting結果顯示，重組蛋白可以與綿羊肺炎支原體陽性血清發生特異性結合(圖5)，證明該目的蛋白具有良好的反應原性。

2.5 間接ELISA方法的建立

由表1可知，當抗原蛋白的包被濃度為0.5 μg/mL，一抗血清的稀釋濃度1∶100時,陽性血清D450 nm值約為1且P/N值最大。由表2可知，血清作用1.5 h時，P/N值最大，為3.313。由表3可知，將酶標二抗進行1∶4 000稀釋時，P/N值最大，為4.171。

圖5 純化的重組蛋白Western blotting鑒定結果Fig.5 Western blotting identification results of purificated recombinant protein

表1 抗原最佳包被濃度及一抗血清最佳稀釋度的確定(D450 nm值)

表2 一抗最佳孵育時間確定(D450 nm值)

2.5 間接ELISA方法的驗證

2.5.2 特異性試驗 利用建立的間接ELISA方法對小反芻獸疫病毒、口蹄疫病毒、布氏桿菌、牛支原體、絲狀支原體山羊亞種及綿羊肺炎支原體的陽性血清進行檢測，D450 nm值分別為0.131、0.200、0.176、0.169、0.191和0.792。結果表明，除綿羊肺炎支原體陽性血清外，其余均顯示為陰性，證明本方法具有較好的特異性。

2.5.3 敏感性試驗 利用建立的間接ELISA鑒定，結果顯示，當標準陽性血清稀釋度為1∶2 048時，D450 nm值>0.36(表4)，因此判定為陽性，說明本方法具有較高的敏感性。

表4 敏感性檢測結果

2.5.4 重復性試驗 用建立的ELISA方法檢測血清樣本后，計算批內重復試驗的變異系數為2.6%～5.0%，批間重復試驗的變異系數為2.6%～5.7%，且二者的變異系數均<10%(表5)，說明建立的間接ELISA方法重復性較好，檢測結果較穩定。

表5 重復性試驗結果

2.5.5 臨床樣品的檢測 利用本試驗建立的間接ELISA方法和綿羊肺炎支原體血凝診斷試劑盒，同時檢測內蒙古某羊場采集的92份血清樣本，2種方法均判定為陽性的血清有31份，二者的陽性符合率為81.6%(31/38)；2種方法均判定為陰性的血清有50份，二者的陰性符合率為92.6%(50/54)，總符合率為88.0%[(31+50)/92](表6)。

表6 臨床樣本的檢測結果

3 討 論

綿羊肺炎支原體在養殖密度較大的養殖場極易通過呼吸道進行大規模傳播，因此一旦有羊感染病原，很快便會在羊群之間擴散開來，且一年四季均有發生，以秋冬季為主[9]。羔羊的發病率高達90%，易與其他病原混合感染，常見的有肺炎鏈球菌、巴氏桿菌及化膿桿菌[10]。普遍認為，綿羊肺炎支原體膜蛋白上的黏附因子是其致病的關鍵原因，這其中也包括了主要保護性抗原。有研究人員提取了綿羊肺炎支原體的膜蛋白，發現上面存在多種免疫原性蛋白[11]。根據本實驗室對分離到的綿羊肺炎支原體NM2010株基因組測序結果及生物信息學分析，綿羊肺炎支原體P60基因全長1 602 bp，GC含量29.2%，第1～57 bp為信號肽區域[7]，由于其影響蛋白的折疊，故設計引物時將信號肽區域的序列截去，保留能夠刺激機體產生免疫應答的抗原表位，而P60基因編碼的膜表面脂蛋白是參與免疫反應的重要抗原成分，故本試驗在保留目的基因完整的功能結構域的基礎上截取一段連續的主要抗原表位進行原核表達。

Mcauliffe等[12]首次以綿羊肺炎支原體的16S DNA為靶基因，建立了PCR檢測方法，但PCR所用到的設備比較多且價格昂貴，不適用于一般實驗室；林裕勝等[13]建立了可以同時檢測綿羊肺炎支原體和絲狀支原體山羊亞種的雙重TaqMan探針熒光定量PCR，該方法操作繁瑣，成本較高；趙萍等[14]通過血凝抑制試驗來檢測綿羊肺炎支原體血清抗體，然而會有假陽性或假陰性結果出現。與之相比，間接ELISA以快速、敏感、可批量檢測樣品等優點，更適于臨床檢測大量血清樣品。目前已建立了基于綿羊肺炎支原體全菌蛋白[15]、P60(N)-P65(C)[16]、P71[17]、P108[18]、P113[19]、P130[20]、EF-TU[21]、HSP70[22]及烯醇化酶[23]等抗體檢測方法，因各蛋白的功能不同，篩選出優勢蛋白作為該病原的診斷抗原尤為重要。大腸桿菌原核表達系統表達分子質量較大的蛋白時易產生包涵體，而包涵體需要用尿素變性后復性才能得到可溶性蛋白，變性復性過程較復雜，但本試驗通過優化誘導時間并純化后獲得了較單一的P6058aa-928aa蛋白，綜合Western blotting結果證明該蛋白具有良好的反應原性，可將其作為間接ELISA方法的包被抗原。 與P60(N)-P65(C)蛋白相比，P6058aa-928aa蛋白包被時所需抗原量更少，并且發現用單一蛋白P6058aa-928aa作為診斷抗原時敏感性和重復性優于串聯蛋白。而采用全菌作為包被抗原時，其復雜的抗原成分，很容易與其他病原產生的抗體發生交叉反應，這種非特異性的結合會影響間接ELISA方法的準確性，所以本試驗利用篩選得到的優勢抗原進行包被有效地避免了該情況的發生。而間接ELISA方法較病原分離法更易操作，適合牧場檢測時使用，另外對儀器設備和實驗室環境也沒有過高的要求。

本研究建立的綿羊肺炎支原體間接ELISA抗體檢測方法能夠特異性檢測綿羊肺炎支原體陽性血清而不與口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒和絲狀支原體山羊亞種等6種病原體的標準陽性血清發生交叉反應，進而證明了P6058aa-928aa蛋白純化成功，以該蛋白作為包被抗原時特異性較強。同時用間接血凝方法和本方法對92份臨床血清樣本進行檢測，二者陽性符合率為81.6%，陰性符合率為92.6%，總符合率為88.0%，2種方法差異主要在于其原理不同，間接血凝法是通過致敏的綿羊紅細胞與相應的抗體結合，使紅細胞聚集，出現的肉眼可見的凝集反應。一般認為ELISA方法的敏感性要高于間接血凝法，但P60蛋白僅僅是綿羊肺炎支原體眾多黏附樣蛋白中的一種，檢測效能有限，而且綿羊肺炎支原體的生長需要從外界獲得多種營養物質，人工培養難度較大且周期較長，故通過原核表達篩選出抗原性強的蛋白來代替全菌蛋白作為包被抗原是非常重要的。

4 結 論

本研究成功表達了P6058aa-928aa蛋白，并將其作為診斷抗原，建立了檢測綿羊肺炎支原體血清抗體的間接ELISA方法，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，一抗血清的最佳稀釋濃度為1∶100，一抗最佳孵育條件為37 ℃、1.5 h，該方法與間接血凝法的總符合率為88.0%，說明建立的間接ELISA方法比較可靠，可用于臨床樣本的檢測，為綿羊肺炎支原體的診斷及流行病學調查提供了較為可靠的方法。