鴨源大腸桿菌的分離鑒定及致病性分析

董洪燕，宋海港，朱善元，于圣青，謝 軍，洪雙鵬，郭長(zhǎng)明，徐 海，高月秀

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

禽致病性大腸桿菌(APEC)是禽大腸桿菌病的主要病原，可引起禽類(lèi)的氣囊炎、肝周炎、心包炎等癥狀，也是導(dǎo)致水禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一[1]。近年來(lái)，隨著水禽業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大和增加，鴨源大腸桿菌病的發(fā)生也日益頻繁和復(fù)雜，且其血清型眾多，常引起繼發(fā)性感染，從而給該病的防控帶來(lái)巨大的困難[2-3]。禽致病性大腸桿菌含有多種毒力因子，其致病性由多種毒力基因協(xié)同作用[4]，目前雞源的毒力因子檢測(cè)研究較多，鴨源的較少[5]。此外，經(jīng)相關(guān)研究表明，特定的O抗原與大腸桿菌的致病性有關(guān)[6]，同時(shí)血清型與菌株所攜帶的毒力基因也存在一定關(guān)系[7-8]。因此，加強(qiáng)鴨源大腸桿菌病的監(jiān)測(cè)與致病性分析，對(duì)養(yǎng)鴨場(chǎng)的健康發(fā)展以及研究鴨源大腸桿菌的血清型、毒力基因與致病性之間的相互關(guān)系具有重要意義。本研究從江蘇、江西以及安徽地區(qū)不同養(yǎng)鴨場(chǎng)病死鴨的病料中分離鴨源大腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行生化和血清型鑒定、毒力基因檢測(cè)、雛鴨致病性試驗(yàn)，并對(duì)毒力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線以及半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定，為鴨源大腸桿菌的防控以及致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病料采自江蘇、江西、安徽地區(qū)不同養(yǎng)鴨場(chǎng)病死鴨的心臟、肝臟、腎臟等臟器，共采集293份病料，其中江蘇95份，江西110份，安徽88份。300只7日齡櫻桃谷鴨購(gòu)自泰州麗佳禽業(yè)有限公司。0.45%氯化鈉、GN生化鑒定卡購(gòu)自梅里埃公司；2×ESTaqMaster Mix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；LB培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基均購(gòu)自北京陸橋公司；GelRed染劑購(gòu)自Biotium公司；大腸桿菌O1、O2、O18和O78單因子診斷血清均購(gòu)自SSI公司。

1.2 方法

1.2.1 鴨源大腸桿菌的分離鑒定 無(wú)菌采取病死鴨心臟、肝臟、腎臟等臟器組織劃線接種于麥康凱鑒別培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)，再挑取疑似菌落分別轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)18～24 h，運(yùn)用全菌裂解法[9]提取細(xì)菌DNA。參照文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)大腸桿菌鑒定引物(表1)，對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR鑒定，PCR結(jié)果經(jīng)北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.2.2 生化鑒定 將分離到的菌株劃線接種于LB平板中，37 ℃培養(yǎng)18 h后，用0.45%氯化鈉調(diào)成0.50～0.62個(gè)麥?zhǔn)媳葷岫鹊木鷳乙海賹⒕鷳乙汉虶N生化鑒定卡片放于VITEK微生物生化鑒定儀中進(jìn)行鑒定。

1.2.3 O血清型鑒定 參照文獻(xiàn)[6]中大腸桿菌血清型鑒定引物(表1)以及PCR方法對(duì)鴨源大腸桿菌分離株的血清型進(jìn)行初步鑒定，鑒定為陽(yáng)性的分離株再進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)驗(yàn)證[1]。

1.2.4 毒力基因檢測(cè) 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)18種毒力基因的檢測(cè)引物(表1)。引物均由賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司合成。 PCR反應(yīng)體系20 μL：2×Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

表1 引物信息

1.2.5 雛鴨致病性試驗(yàn) 取300只7日齡健康櫻桃谷鴨隨機(jī)分成74個(gè)試驗(yàn)組及1個(gè)對(duì)照組(4只/組)，將新鮮培養(yǎng)的74株鴨源大腸桿菌分離株菌液濃度調(diào)至108CFU/mL。 試驗(yàn)組按0.1 mL/只腹腔注射菌液，對(duì)照組注射等量PBS后隔離飼養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病及死亡情況直至第7天。死亡鴨及時(shí)剖檢并做細(xì)菌分離培養(yǎng)及PCR檢測(cè)。

1.2.6 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 挑取毒力較強(qiáng)以及2株毒力較弱分離株的單個(gè)菌落分別接種于10 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；將細(xì)菌懸液按照1∶100的比例接種至100 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min搖振培養(yǎng)，每隔1 h取200 μL細(xì)菌懸液測(cè)D600 nm值，連續(xù)12 h，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定。

1.2.7 LD50測(cè)定 選取毒力強(qiáng)的鴨源大腸桿菌分離株，根據(jù)D600 nm值將細(xì)菌濃度調(diào)至109或108CFU/mL，10倍倍比稀釋至106或105CFU/mL進(jìn)行LD50測(cè)定，再根據(jù)毒力強(qiáng)的鴨源大腸桿菌分離株的數(shù)量，將7日齡櫻桃谷鴨隨機(jī)分組，每組8只，每只腹腔接種0.1 mL菌液(對(duì)照組接種等量的PBS)，感染后觀察7 d，記錄雛鴨的死亡情況，并根據(jù)Reed-Muench方法[10]計(jì)算LD50。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。本研究中生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)進(jìn)行雙尾獨(dú)立T檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 鴨源大腸桿菌分離鑒定

根據(jù)臨床癥狀共收集293份樣品，其中74份樣品在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出粉紅色、表面光滑、邊緣整齊的圓形菌落；74株分離株經(jīng)特異性PCR鑒定，均擴(kuò)增出720 bp的目的條帶(部分結(jié)果見(jiàn)圖1)，與預(yù)期片段大小一致。測(cè)序比對(duì)結(jié)果初步表明，74株分離株均為大腸桿菌。生化試驗(yàn)結(jié)果表明，這些菌株均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；吲哚、MR實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性；枸櫞酸鹽、VP為陰性；不產(chǎn)生H2S。說(shuō)明分離到了74株大腸桿菌，總檢出率為25.26%，其中江蘇、江西以及安徽地區(qū)檢出率分別為45.26%、17.27%和13.64%。

M,100 bp DNA Marker;1～22，部分分離株;23,陽(yáng)性對(duì)照;24,陰性對(duì)照M,100 bp DNA Marker;1-22,Partial isolates;23,Positive control;24,Negative control圖1 部分分離菌株P(guān)CR鑒定Fig.1 PCR identification of partial isolates

2.2 鴨源大腸桿菌血清學(xué)鑒定

74株鴨源大腸桿菌分離株經(jīng)O血清型鑒定結(jié)果顯示，目的片段為263、355、459、623 bp的菌株分別有1、2、2、4株(圖2)，再通過(guò)玻板凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，與PCR結(jié)果一致；剩余65株分離株因血清交叉凝結(jié)嚴(yán)重暫未定型。以上結(jié)果表明，O1血清型菌株為1株，占1.35%；O2血清型菌株為2株，占2.7%；O18血清型菌株為2株，占2.7%；O78血清型菌株為4株，占5.4%。

2.3 鴨源大腸桿菌毒力基因檢測(cè)

對(duì)74株鴨源大腸桿菌分離株進(jìn)行18種毒力基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，ibeB和yijp基因的檢出率最高，均為97.3%(72/74)；OmpA、mat、iucD和fimC基因的檢出率分別為95.95%(71/74)、90.54%(67/74)、78.38%(58/74)和77.03%(57/74)；papC、vat、cva/cvi和chuA基因均只有1個(gè)菌株檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果，檢出率均為1.35%(1/74)(圖3)，表明74株分離株毒力基因譜分布廣泛。

74株分離株均含有2種或者2種以上的毒力基因，最高可攜帶13種毒力基因，其中攜帶6種毒力基因的細(xì)菌數(shù)為26株，攜帶7種毒力基因的細(xì)菌數(shù)有18株(圖4)。

M,100 bp DNA Marker;1,O1血清型菌株;2、3,O2血清型菌株;4、5,O18血清型菌株;6～9,O78血清型菌株M,100 bp DNA Marker;1,Serotype O1 isolate;2 and 3,Serotype O2 isolates;4 and 5,Serotype O18 isolates;6-9,Serotype O78 isolates圖2 鴨源大腸桿菌分離菌株O血清型鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of the serotype O of Escherichia coli isolates from ducks

圖3 74株鴨源大腸桿菌攜帶毒力基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.3 Distribution of virulence genes in 74 strains of Escherichia coli isolates from ducks

圖4 毒力基因分布情況Fig.4 Distribution of 18 virulence genes

2.4 鴨源大腸桿菌致病性測(cè)定

74株鴨源大腸桿菌使用107CFU/只的劑量腹腔接種7日齡健康非免疫櫻桃谷鴨，雛鴨感染后，接種了分離株2019JS001和2019JS009的雛鴨于24 h開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡，食欲減退，不愿飲水，逐漸消瘦，嗜睡，排黃白色糞便等癥狀，隨后部分雛鴨出現(xiàn)死亡；剖檢可見(jiàn)肝臟腫大，呈青銅色，部分雛鴨肝臟與心臟都有黃白色纖維素性滲出物，腹膜炎，腹部有滲出物，對(duì)照組雛鴨各方面均正常。各試驗(yàn)組雛鴨感染鴨源大腸桿菌分離株后均有不同程度的發(fā)病，其中2株鴨源大腸桿菌(2019JS001、2019JS009)感染鴨的死亡率≥50%，說(shuō)明其毒力較強(qiáng)。另外2株鴨源大腸桿菌分離株2019JS002、2019JS010感染鴨后，其癥狀較輕，死亡率為0，說(shuō)明其毒力較弱。

2.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將毒力較強(qiáng)的分離株2019JS001、2019JS009株以及2株毒力較弱分離株2019JS002、2019JS010經(jīng)連續(xù)12 h生長(zhǎng)曲線測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其生長(zhǎng)曲線均呈上升趨勢(shì)，且毒力較強(qiáng)和較弱分離株生長(zhǎng)速度之間差異均不顯著(P>0.05)(圖5)，說(shuō)明分離株2019JS001、2019JS009株的毒力較強(qiáng)與生長(zhǎng)速度快慢無(wú)關(guān)。

同一時(shí)間不同菌株相比，無(wú)*，差異不顯著(P>0.05)Compared with different strains at the same time,no*，no significant difference (P>0.05)圖5 4株鴨源大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線圖Fig.5 The growth curve of 4 strains of Escherichia coli isolates from ducks

2.6 LD50測(cè)定

將菌株2019JS001、2019JS009培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別用PBS稀釋至最終接種劑量分別為108、107、106、105、104CFU和 109、108、107、106、105CFU，每個(gè)劑量分別接種8只雛鴨觀察7 d后，計(jì)算LD50分別為104.75和107.375CFU。

3 討 論

近期來(lái)，在水禽養(yǎng)殖過(guò)程中鴨源大腸桿菌引起的繼發(fā)性疾病較多，形勢(shì)嚴(yán)峻復(fù)雜[11]。本研究根據(jù)臨床癥狀共采樣293份，通過(guò)PCR以及生化鑒定出74株鴨源大腸桿菌，總檢出率為25.26%，其中江蘇、江西以及安徽地區(qū)檢出率分別為45.26%、17.27%和13.64%。

大腸桿菌血清型眾多，主要分為O、K、H、F 4種抗原，其中O抗原至少有173種[12]。中國(guó)西南地區(qū)以O(shè)76、O78、O92、O93為優(yōu)勢(shì)血清型[13]；山東部分地區(qū)以O(shè)2、O21、O73、O78、O83、O119、O139血清型為主[14]；廣東地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清以O(shè)2、O20、O78、O86、O65為主[15]；因此不同地區(qū)的血清型具有地方特異性。國(guó)內(nèi)外有研究表明，其中有50%的禽致病性大腸桿菌暴發(fā)病例主要與血清型O1、O2、O18、O78有關(guān)[6]。因此，本研究74株鴨源大腸桿菌主要對(duì)這4種血清型進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明O1血清型有1株，O2和O18血清型各2株，O78血清型有4株；其余菌株因大腸桿菌血清交叉凝結(jié)現(xiàn)象較嚴(yán)重，均未定型。

毒力基因是致病菌引起機(jī)體發(fā)病的重要因素，目前發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的毒力基因主要包括黏附素、侵襲素、溶血素、鐵攝取系統(tǒng)、抗血清存活因子和空泡形成毒素等[16]。本研究74株分離株中，97.3%的菌株均檢測(cè)出侵襲性相關(guān)基因ibeB和yijp，這兩個(gè)基因是大腸桿菌侵襲腦血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的細(xì)菌毒力因子[17]，其次是OmpA基因(抗血清存活因子)和mat基因(黏附相關(guān)基因)，檢出率均>90%，iucD基因(攝鐵系統(tǒng)相關(guān)基因)和fimC基因(黏附相關(guān)基因)均>75%，這與福建[1]、河南[3]、河北[18]等地檢出的主要毒力基因不同，表明鴨源大腸桿菌流行的地區(qū)不同，攜帶的主要毒力基因也存在差異。74株分離株有12種毒力基因譜，其中攜帶6種和7種毒力基因的占59.46%，最高的攜帶13種毒力基因。由于禽致病性大腸桿菌毒力因子組成復(fù)雜，并且相互作用導(dǎo)致該病的暴發(fā)，因此，加強(qiáng)對(duì)鴨源大腸桿菌毒力基因的監(jiān)測(cè)具有重要意義，有助于大腸桿菌病的防控，并且降低該病對(duì)水禽養(yǎng)殖業(yè)的危害。

雛鴨致病性試驗(yàn)表明，74株分離株均有不同程度的致病性，經(jīng)107CFU/只攻毒后，僅有2株大腸桿菌(2019JS001，2019JS009)感染鴨的死亡率≥50%，與李迎曉等[3]研究中的分離株致病性鑒定結(jié)果不同，這可能與不同地區(qū)分布不同以及血清型為O1、O2、O18、O78菌株較少有關(guān)[6]。隨后對(duì)2019JS001和2019JS009株進(jìn)行LD50測(cè)定，其分別為104.75和107.375CFU，同時(shí)這2株分離株均為非O1、O2、O18、O78血清型菌株，18種毒力基因中分別鑒定出12和11種毒力基因譜，都攜帶tsh、mat、fimC、ibeB、yijp、OmpA、neuC、iss、iron和iucD基因，這與其他研究[19-20]表明致病性大腸桿菌的致病性與毒力基因密切相關(guān)，且毒力較強(qiáng)的菌株均攜帶4個(gè)以上毒力基因的結(jié)果一致。因此，加強(qiáng)對(duì)鴨源禽致病性大腸桿菌的血清型、毒力基因譜以及致病性的監(jiān)測(cè)，可以對(duì)該病的預(yù)防控制以及研究三者之間的相互關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)臨床癥狀共采樣293份，通過(guò)PCR以及生化鑒定出74株鴨源大腸桿菌；其中O1、O2、O18和O78血清型分別有1、2、2和4株，其余菌株因大腸桿菌血清交叉凝結(jié)現(xiàn)象較嚴(yán)重，尚未定型；74株分離株有12種毒力基因譜，其中攜帶6和7種毒力基因占59.46%，最高攜帶13種毒力基因；動(dòng)物致病性試驗(yàn)表明，經(jīng)107CFU/只攻毒后，74株分離株均引起雛鴨不同程度發(fā)病，但僅有2株分離株毒力較強(qiáng)，其LD50分別為104.75和107.375CFU。