傣藥龍血竭對(duì)腦缺血大鼠的腦保護(hù)作用

張曉燕，蔡宇宇，王玉瑤，孫海珍

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

龍血竭是一種紅色的樹(shù)脂，1972年在中國(guó)云南省發(fā)現(xiàn)的龍血竭（Longxue Jie）來(lái)源于百合目龍舌蘭科劍葉龍血樹(shù) Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen 的樹(shù)脂提取物，亦稱(chēng)“廣西血竭”，是民族傣藥“龍血竭”的主要來(lái)源。其藥理作用有抗炎作用：臨床上龍血竭合用美沙拉嗪能降低TNF-α、IL-6及CRP的水平，從而治療結(jié)腸炎[1]，龍血竭能抑制肺組織的炎癥程度和膠原過(guò)度沉積達(dá)到急性炎癥治療[2]；活血化瘀作用：研究表明PAI-1 能增加動(dòng)靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，龍血素B能有效的阻止uPA/PAI-1復(fù)合物的形成，抑制PAI-1的活性，而產(chǎn)生活血化瘀作用[3-4]；抗肝/肺纖維化作用：龍血竭抑制 IL-2和上調(diào) IL-5等炎癥因子，降低透明質(zhì)酸和轉(zhuǎn)氨酶而產(chǎn)生降低肝/肺纖維化的作用[5-6]。降糖、降脂作用：龍血竭的有效成分總黃酮能降低三酰甘油、總膽固醇，降低 IL-6，提高胰島素產(chǎn)生降糖降脂的作用[7]。目前臨床應(yīng)用于心血管疾病[8]，皮膚科疾病[9-11]，婦產(chǎn)科疾病[12-13]，消化系統(tǒng)疾病[14-15]和肛腸科疾病[16-17]等。

腦缺血（Cerebral Ischemia，CI）是微循環(huán)障礙性疾病。臨床顯示，老年人是缺血性腦卒中的易患人群，可能與并發(fā)癥高血壓，高血脂有關(guān)[18]。腦卒中具有較高發(fā)病率、致死率、致殘率、復(fù)發(fā)率特點(diǎn)[19]，中醫(yī)認(rèn)為，腦和五臟具有密切的聯(lián)系，產(chǎn)生腦卒中病癥時(shí)，有害物質(zhì)可運(yùn)送到重要器官，導(dǎo)致器官損傷。中藥多成分，多靶點(diǎn)和良反應(yīng)少[20]，因此在臨床生有著重要意義。本文研究中藥龍血竭抗腦缺血藥效作用，為今后龍血竭在心腦血管疾病和神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑

龍血竭(龍血竭制成粉末，批號(hào)：20191106)：廣西中醫(yī)藥研究院；腦心通膠囊（規(guī)格0.4 g/粒，批號(hào)：1911166）：陜西步長(zhǎng)制藥有限公司；2%TTC染液（批號(hào) 20190925）：北京索萊寶科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號(hào)：20090514）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；GSH-Px（批號(hào)：A005-1）、SOD（批號(hào)：A001-3）、MDA（批號(hào)：A003-1）、CAT（批號(hào)：A007-1-1）試劑盒：南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅染液（HE，批號(hào)202105）：武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，9周歲，體質(zhì)量（260±20） g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（黑）2018-007，飼養(yǎng)條件：溫度 25 ℃，濕度 50%，晝夜間隔12 h，自由飲水。

1.2 儀器與設(shè)備

XW-80A渦旋混合器：上海琪特分析儀器有限公司；CM-36型圓形水浴氮吹儀：北京成萌偉業(yè)科技有限公司；M200 PRO酶標(biāo)儀：瑞士帝肯集團(tuán)公司；YD1508R輪轉(zhuǎn)式病理切片機(jī)：德國(guó)徠卡公司；TB-P1自動(dòng)包埋機(jī)：上海名元實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 造模

大鼠術(shù)進(jìn)食供水12 h，以10%水合氯醛溶液腹腔注射大鼠，將四肢和頭部固定在試驗(yàn)臺(tái)上，頸正中剪開(kāi)皮膚約2 cm切口，鈍性分離，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA）。分離出CCA，找到動(dòng)脈Y型分叉，取縫合線于左側(cè)CCA遠(yuǎn)心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉 ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。在CCA分叉處，近心端約4 mm處傾斜45度剪切口，將線栓（魚(yú)線剪成5 cm長(zhǎng)的線段，5 mm以下蘸取石蠟）從切口處朝 ICA入顱方向插入，感到有輕微阻力即停止。扎緊，縫合，將魚(yú)線尾部露出體外。用燈照射保持肛溫為37 ℃，90 min后將魚(yú)線拔出約2 cm并剪去露出體外部分。假手術(shù)組僅將大鼠皮膚切開(kāi)，剝離暴露CCA、ECA及ICA后縫合。

1.3.2 模型判斷指標(biāo)

采用Zea Longa5 級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)（無(wú)神經(jīng)功能損傷（0分），對(duì)側(cè)前肢伸展障礙（1分），向手術(shù)對(duì)側(cè)打圈（2分），行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒（3分），意識(shí)昏迷（4分）），篩選成功模型（大于0分），未入選大鼠棄之。

1.3.3 動(dòng)物分組與給藥

將有效造模大鼠隨機(jī)分為六組，分別為假手術(shù)組（Sham）、模型組（Model）、龍血竭組（高（DBH）、中（DBM）、低（DBL）組）和腦心通膠囊組（NXT），每組20只，灌胃劑量按照1 mL/100g計(jì)算，灌胃 1次/d，連續(xù)灌胃14 d。

假手術(shù)組（Sham）和模型組（Model）給予生理鹽水。

龍血竭組：將其分為高（DBH）、中（DBM）、低（DBL）組，是通過(guò)取適量龍血竭混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液中，配制成濃度的分別2.16、1.08、0.54 g/kg的混懸液。

腦心通膠囊組（NXT）：規(guī)格為每粒 0.4 g，根據(jù)劑量換算，用純水配制成濃度為54 mg/kg的混懸液。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.4.1 神經(jīng)功能評(píng)分 在術(shù)后第 1、4、7、14 d參照改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS），神經(jīng)功能評(píng)分在0～18分之間，0分為正常；1～6分為輕度神經(jīng)功能缺損；7～12分為中度缺損；13～18分為重度缺損。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Nerve function scoring criteria

1.3.4.2 腦組織含水量（%）及腦梗死體積測(cè)定腦組織含水量：各組隨機(jī)選取6只大鼠，于第7 d灌胃給藥后進(jìn)行斷頭取腦，精密稱(chēng)濕重，后80 ℃干燥至恒重，稱(chēng)三次取均值。

腦組織含水量（%）=（腦組織濕重–腦組織干重）/腦組織濕重×100%

腦梗死體積（%）=（非缺血側(cè)半球面積–缺血側(cè)半球未梗死面積）/全腦面積×100%

1.3.4.3 HE染色和 TTC染色 將各組大鼠在術(shù)后第 14 d行神經(jīng)功能缺損評(píng)分后，隨機(jī)選取 12只，隨機(jī)取6只用水合氯醛腹腔麻醉，打開(kāi)胸腔、暴露心臟，剪開(kāi)右心耳，自左心尖灌注0.9%氯化鈉溶液，當(dāng)右心耳流出無(wú)血色液體，斷頭取腦，大鼠的腦組織于–20 ℃冰箱中20 min后進(jìn)行常規(guī)的TTC染色。其余6只進(jìn)行相同步驟，通過(guò)氯化鈉處理后，用4%多聚甲醛從左心尖灌注，當(dāng)全身僵硬，迅速斷頭，取腦，置于4%多聚甲醛固定液中，進(jìn)行HE染色。

1.3.4.4 對(duì)血清中的氧化應(yīng)激水平的影響 將各組大鼠禁食供水12 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，置于10 mLEP管室溫靜置1 h后，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，合并同組大鼠血清。采用酶標(biāo)儀對(duì)SOD、MDA、GSH-PX、CAT進(jìn)行活性檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分和腦組織含水量采用單因素方差分析（ANOVA），用spss25.0進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，作圖使用Graphpad Prism9，圖像分析采用Image Pro Plus 6.0，兩組間采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，表示有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 對(duì)神經(jīng)功能的影響

Sham組大鼠的神經(jīng)功能從輕微損傷恢復(fù)至正常；Model組的神經(jīng)功能缺損明顯且損傷長(zhǎng)期存在。給藥組與Model組相比，給藥組神經(jīng)功能評(píng)分降低趨勢(shì)一致，均有顯著改善（P<0.01）；第14 d DBH/M組的神經(jīng)受損恢復(fù)最好，且優(yōu)于NXT組，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較Table 2 Comparison of neurological function scores in rats

2.1.2 對(duì)腦組織含水量及腦梗死體積的影響

相比 Sham 組，Model組大鼠腦組織含水量顯著增加（P<0.01）。給藥組大鼠腦組織含水量較Model組均低，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01），HBH與NXT兩者的含水量基本相同，表明龍血竭可降低腦組織含水量，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量Table 3 Percentage of brain water content in rats

Sham組可見(jiàn)均勻紅色腦組織切片，腦組織切片未見(jiàn)梗死病灶（0.00%±0.00）,與Sham組相比，Model組大鼠術(shù)側(cè)腦組織梗死明顯且體積較大（45.13%±4.05，P<0.01）；與 Model組相比，各給藥組白色梗死區(qū)域均相對(duì)減少，尤其是 DBH（32.42%±2.57，P<0.01）和 DBM 組（34.84%±3.30，P<0.05）。治療效果優(yōu)于 NXT組。認(rèn)為龍血竭能夠不同程度的改善腦組織供血不足，降低大鼠缺血側(cè)腦梗死體積，見(jiàn)圖1。

圖1 腦梗死體積Fig. 1 Cerebral infarction volume

2.1.3 對(duì)腦組織學(xué)的影響

Sham組細(xì)胞完整，分布均勻，細(xì)胞核居中，核仁清晰。Model組中有明顯組織結(jié)構(gòu)異常，結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞分布不均勻，可見(jiàn)大量細(xì)胞核移位及固縮，排列稀疏，血管周?chē)鶹-R腔增寬。相比Model組，各給藥組僅皮層少數(shù)細(xì)胞固縮，且DBH/M組可見(jiàn)異常變化較少，個(gè)別神經(jīng)元固縮，皮層固縮細(xì)胞數(shù)量減少，小膠質(zhì)細(xì)胞有顯著修復(fù)，見(jiàn)圖2。

圖2 腦組織HE染色切片圖Fig. 2 HE stained sections of brain tissue

2.1.4 對(duì)氧化應(yīng)激的影響

與Sham組相比，Model組SOD活力下降顯著（P<0.01），GSH-PX及CAT活力有所下降（P<0.05），MDA含量上升不明顯（P>0.05）。與Model相比，龍血竭組SOD、GSH-PX活力均有顯著提高（P<0.05 或P<0.01），且 DBH組能顯著降低MDA含量（P<0.05）。其中，NXT組降低 MDA含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），提高 CAT、SOD活力作用有顯著差別（P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 對(duì)CI大鼠氧化應(yīng)激水平的影響Table 4 Effects on oxidative stress levels in CI rats

2.2 試驗(yàn)分析

近年來(lái)大腦中動(dòng)脈栓塞模型（MCAO廣泛應(yīng)用于腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，因?yàn)樗c人腦缺血相似，不需要顱骨切除，損傷小。腦缺血再灌注能使腦部造成更大的損傷，更好地模擬腦缺血的行為改變和病理特征[21]，由于腦缺血復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，包括興奮毒性、離子失衡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等[22]，防治腦缺血的問(wèn)題也在更深層次的探索當(dāng)中。腦缺血缺氧后，腦組織代謝異常、腦內(nèi)氧化應(yīng)激與自由基的過(guò)量產(chǎn)生，細(xì)胞膜通透性增加，低氧環(huán)境導(dǎo)致白細(xì)胞滲入低氧組織細(xì)胞水腫，引起血腦屏障滲漏和水腫，導(dǎo)致腫瘤壞死因子升高，從而引發(fā)細(xì)胞炎性因子釋放，損傷腦組織中內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞，引起細(xì)胞酸中毒，能量代謝障礙等。隨后導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，缺血再灌注期間神經(jīng)功能的下降[23-26]。

當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)被破壞，所產(chǎn)生的有害物質(zhì)超出自生調(diào)節(jié)，由于腦部對(duì)缺血缺氧非常敏感，因此腦組織會(huì)產(chǎn)生微循環(huán)障礙，細(xì)胞膜通透性增加，引起腦組織含水量增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本，最廣泛的技術(shù)方法[27]。蘇木精染液為堿性，使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸顯紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。由試驗(yàn)[28]表明，頸動(dòng)脈狹窄解除能夠降低腦組織含水量，也使血腦屏障的通透性降低含水量。本試驗(yàn)中龍血竭組降低腦組織含水量，其可能是通過(guò)降低血腦屏障通透性而產(chǎn)生的效果。根據(jù)文獻(xiàn)[29]可知，給藥組多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)改變相對(duì)較輕，核固縮少，排列整齊，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，可推斷出龍血竭能改善海馬體組織，從而達(dá)到腦保護(hù)作用。腦缺血再灌注后引起一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)[30-31]，并且氧化應(yīng)激負(fù)荷時(shí)，自由基產(chǎn)生過(guò)量，導(dǎo)致有害產(chǎn)物丙二醛（MDA）等水平升高，病情加重。而SOD、CAT、GSH-Px能清除過(guò)氧化物，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[32]的作用。由研究[33-34]表明，不同濃度羽扇豆醇，能使血清 SOD和 GSH水平升高，MDA水平降低，從而增加抗氧化物酶活性，有效減少氧化應(yīng)激損傷，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，且DBH組降低MDA水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于NXT組，表明龍血竭組有較好的腦保護(hù)作用。

嚴(yán)重腦缺血能大面積腦梗塞，當(dāng)達(dá)到四分之三梗阻會(huì)出現(xiàn)偏癱、偏身感覺(jué)障礙和嗜睡等現(xiàn)象[35]，TTC是脂溶性光敏感復(fù)合物，1958 年開(kāi)始用來(lái)檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織的缺血梗塞[36]。正常組織中脫氫酶活性高可與TTC反應(yīng)顯紅色，缺血組織顯白色。梁萍[37]研究中提到，腦梗死面積減小能恢復(fù)腦部神經(jīng)和記憶，本試驗(yàn)龍血竭組能減少腦阻塞面積，且治療效果優(yōu)于 NXT組，有顯著性差異（P<0.05），說(shuō)明也有同樣的腦保護(hù)作用。

3 結(jié)論

龍血竭可降低腦組織含水量和血腦屏障通透性，減輕神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，抑制海馬體組織的損傷，從而達(dá)到腦組織的保護(hù)作用；提高機(jī)體的氧化應(yīng)激能力，增強(qiáng)人體的防御力和神經(jīng)血管的結(jié)構(gòu)和功能，改善腦缺血再灌注組織病理?yè)p傷；龍血竭還能縮小腦梗死面積，恢復(fù)大鼠的記憶和神經(jīng)。說(shuō)明龍血竭對(duì)大鼠腦缺血疾病有一定的保護(hù)作用。