基于網絡藥理學探討固本止崩湯對功能失調性子宮出血的機制研究

曹一鳴 王悅竹 史亞婷 宮瑋珩 劉雁峰

摘要 目的：運用網絡藥理學的方法探討固本止崩湯對功能失調性子宮出血的可能性機制。方法：在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺篩選固本止崩湯的活性成分并預測其潛在作用靶點，將獲得靶點導入UNIPROT數據庫進行基因的標準化處理;在GeneCards和OMIM數據庫查找功能失調性子宮出血的相關靶點。運用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，將二者交集靶點運用STRING平臺分析蛋白間的相互作用關系。用DAVID數據庫對交集靶點進行基因本體（GO）生物功能和富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，并以圖表形式展示。結果：以口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）2個篩選標準得到固本止崩湯中有效活性成分58個，得到靶點135個;在GeneCards和OMIM查找功能失調性子宮出血靶點共2 164個，韋恩圖獲得藥物與疾病的交集靶點共85個，關鍵靶點涉及IL6、VEGFA、TP53、TNF、EGF等。以P富集分析得到GO條目135條，其中生物過程38條、分子功能36條、細胞組分61條，主要涉及對缺氧的反應、一氧化氮生物過程的正向調節、細胞外空間、細胞外區域、酶結合、類固醇結合等;KEGG富集分析得到25條通路（P<0.05，FDR<0，05），靶基因主要富集在癌癥信號通路等信號通路中。結論：固本止崩湯治療功能失調性子宮出血具有多成分、多靶點、多通路的特點，其作用機制較為復雜，為后續的實驗驗證提供物質基礎和理論依據。

關鍵詞 網絡藥理學;中醫;固本止崩湯;功能失調性子宮出血;靶點;分子機制;信號通路;富集分析

Study on the Mechanism of Guben Zhibeng Decoction in the Treatment of Dysfunctional Uterine Bleeding Based on Network Pharmacology

CAO Yiming，WANG Yuezhu，SHI Yating，GONG Weiheng，LIU Yanfeng

（Dongzhimen Hospital，Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 101121，China）

Abstract Objective：To explore the possible molecular mechanism of Guben Zhibeng Decoction in the treatment of dysfunctional uterine bleeding by means of network pharmacology.Methods：The active components of Guben Zhibeng Decoction were screened on the platform of pharmacology database of traditional Chinese medicine system and their potential action targets were predicted，and then the obtained targets were imported into UNIPROT database for gene standardization treatment; the related targets of dysfunctional uterine bleeding was searched in GeneCards and OMIM databases.The network diagram of “drug-component-target-disease” was constructed by using Cytoscape 3.7.2 software，and the interaction between proteins was analyzed by using STRING online platform.GO biological function and KEGG pathway enrichment were analyzed by DAVID database，and the results were displayed in graph form.Results：A total of 58 effective active ingredients in Guben Zhibeng Decoction were obtained by OB and DL screening criteria，and 135 targets were predicted.A total of 2 164 targets of dysfunctional uterine bleeding were found in GeneCards and OMIM，and 85 targets of intersection of drugs and diseases were found in Venn diagram.The key targets involved IL6，VEGFA，TP53，TNF，EGF，etc.A total of 135 GO items were obtained by P enrichment analysis，including 38 biological processes，36 molecular functions and 61 cellular components，mainly involving in hypoxia response，positive regulation of nitric oxide biosynthetic process，extracellular space，extracellular region，enzyme binding，steroid binding，etc.A total of 25 pathways were found by KEGG enrichment analysis（P<0.05，FDR<0.05），and the target genes were mainly enriched in cancer signal pathway etc.Conclusion：Guben Zhibeng Decoction has the characteristics of multi-component，multi-target and multi-channel in the treatment of dysfunctional uterine bleeding，and its mechanism is complex，which provides material basis and theoretical basis for subsequent experimental verification.

Keywords Network pharmacology; Traditional Chinese Medicine; Guben Zhibentang; Dysfunctional uterine bleeding; Target; Molecular mechanism; Signal pathway; Enrichment analysis

中圖分類號：R285.5;R271.12;R289.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.009

功能失調性子宮出血是青春期和絕經期發病率較高的婦科疾病[1]，患者主要表現為經血淋漓不盡、經期紊亂等癥狀[2]，嚴重影響患者的身心健康。功能失調性子宮出血多由于營養不良以及精神壓力過大等因素誘發。目前在臨床中多采用激素和刮宮治療功能失調性子宮出血，激素療法不良反應較大，且不適用于有迫切生育要求女性，刮宮療法對患者子宮內膜的創傷較大，可能對患者的生育產生影響[3]。隨著中醫藥的不斷深入研究和發展，中藥在治療功能失調性子宮出血的療效顯著，可以有效調節患者的內分泌功能[4]，進而緩解患者的臨床癥狀和促進月經周期的恢復。

固本止崩湯來源于《傅青主女科》，藥物組成包括熟地黃、白術、黃芪、人參、當歸、黑姜，具有補腎健脾、益氣養血的功效[5]。其中，熟地黃具有滋陰補血之功效;白術和黃芪可以補氣健脾、益氣攝血，引離經之血歸經;人參可以大補元氣;當歸具有調經止痛、補血活血之功效;黑姜可以溫中止痛、溫經散寒[6]。楊梅花[7]在觀察固本止崩湯加減治療98例無排卵性功能失調性子宮出血發現，固本止崩湯加減治療功能失調性子宮出血可以提高血紅蛋白指標，改善凝血功能，促使疾病的轉歸。邱嘉菡等[6]通過臨床研究發現固本止崩湯能有效縮短凝血酶原時間，能夠有效止血，因此能夠有效治療患者的功能失調性子宮出血。固本止崩湯在臨床上被廣泛應用于治療患者的功能失調性子宮出血，但其作用機制尚不明確，因此本文運用網絡藥理學的方法探究固本止崩湯治療功能失調性子宮出血的作用機制，以期為固本止崩湯的應用提供理論基礎和依據。

網絡藥理學成功應用于“目標藥物-疾病-基因”網絡的構建和數據的可視化處理[8]，這有助于從多維度角度和分子機制探討藥物治療疾病的作用機制。網絡藥理學可用于預測藥物活性成分的靶點和相對應的靶向疾病途徑[9]，因此越來越廣泛地應用于預測藥物的活性成分及潛在靶基因。本文運用網絡藥理學的方法，通過預測固本止崩湯的活性成分及潛在靶點，并構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，從分子水平上闡述了固本止崩湯治療功能失調性子宮出血的潛在作用機制，為后續的實驗驗證提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 固本止崩湯活性成分收集 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）分別檢索熟地黃、白術、黃芪、人參、當歸、黑姜的活性成分，以口服利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為篩選標準，得到固本止崩湯的有效活性成分。通過TCMSP數據庫預測所有活性成分的潛在靶點。

1.2 收集功能失調性子宮出血靶點 在OMIM和GeneCards數據庫以“Dysfunctional uterine bleeding”為關鍵詞進行檢索，得到功能失調性子宮出血的疾病相關靶點。

1.3 韋恩圖構建 借助Venn2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線平臺將藥物靶點與疾病靶點取交集，獲得固本止崩湯治療功能失調性子宮出血的關鍵靶點，以韋恩圖展示。

1.4 構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖 將固本止崩湯的活性成分及對應靶點、藥物與疾病的映射靶點賦值后導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。利用軟件中的“Network Analyzer”功能進行分析，并根據Degree值篩選出關鍵活性成分及靶點。其中節點代表藥物、成分、靶點與疾病，邊代表藥物活性成分與靶點以及靶點與疾病之間的相互作用關系。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡核心靶點網絡圖構建 將藥物與疾病的交集靶點上傳至STRING（http：//string-db.org）在線數據庫平臺，并將物種設置為人（“Homo sapiens”），構建藥物與疾病之間的蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡圖。將STRING數據庫得到的數據信息導入至Cytoscape 3.7.2軟件中，并以度值大于平均值為篩選標準，得到固本止崩湯治療功能失調性子宮出血的核心靶點。

1.6 富集分析 將藥物與疾病的交集靶點上傳至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）在線數據庫平臺，將物種設置為人（“Homo sapiens”），并將篩選條件設置為官方基因（Official Gene Symbol）。進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以P<0.05和FDR<0.05為篩選標準，得到固本止崩湯對功能失調性子宮出血的生物功能注釋，包括生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）3個部分，并進行數據的可視化處理;以同樣的方法進行KEGG通路富集分析，得到固本止崩湯作用于功能失調性子宮出血的主要通路，并以表格形式展示。

2 結果

2.1 固本止崩湯活性成分篩選 在TCMSP數據庫檢索得到固本止崩湯所有藥物活性成分，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選標準，得到固本止崩湯有效活性成分58個，其中熟地黃2個、白術7個、黃芪20個、人參22個、當歸2個和炮姜5個;預測得到固本止崩湯靶點共139個。

2.2 藥物與疾病靶點交集韋恩圖 通過檢索OMIM和GeneCards數據庫，刪除重復值后共得到疾病靶點2 164個，將固本止崩湯的潛在作用靶點映射到疾病靶點中，共得到85個交集靶點，制成韋恩圖。見圖1。

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖 利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖共有201個節點，其中藥物活性成分51個、藥物與疾病節點7個、靶點節點143個;其中紅色代表白術活性成分、紫色代表熟地黃活性成分、藍色代表靶點、淺藍色代表黃芪活性成分、黃色代表人參活性成分、綠色代表藥物與疾病名稱，以及淺綠色代表炮姜活性成分，當歸的活性成分β-谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）與人參中的活性成分重復，故圖中未單獨列出。根據Degree值篩選，其中豆甾醇（MOL000449）、β-谷甾醇（MOL000358）、山柰酚（MOL000442）、槲皮素（MOL000098）的度值分別為180、156、112、88，以上活性成分在藥物治療疾病過程中作用較為重要。見圖2。

2.4 PPI網絡圖與核心靶點網絡圖構建及分析 將藥物與疾病的交集靶點導入SRING數據庫構建PPI網絡圖共有85個節點，927條邊，平均節點數為21.8;其中節點代表靶蛋白，邊代表靶蛋白質之間的相互作用關系。見圖3。將STRING數據庫得到的數據導入至Cytoscape 3.7.2軟件中，以Degree>22為篩選條件，得到藥物治療疾病的核心靶點，其中Degree值排名前10的有白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）A、TP53、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）、表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、促分裂原活化的蛋白激酶（Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK）1、Jun激酶、表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）、雌激素受體（Estrogen Receptor，ESR）1、MAPK8，以上靶點在固本止崩湯治療功能失調性子宮出血起到關鍵作用。見圖4。

2.5 GO功能結果分析 利用DAVID數據庫對固本止崩湯作用于功能失調性子宮出血的有效作用靶點進行GO功能富集分析。以P<0.05和FDR<0.05為篩選標準，得到135條GO條目，其中BP相關條目38條。主要涉及對缺氧的反應（Response to Hypoxia）、一氧化氮生物合成的正調節（Positive Regulation of Nitric Oxide Biosynthetic Process）等;CC相關條目36條，主要涉及細胞外空間（Extracellular Space）、細胞外區域（Extracellular Region）等;MF相關條目61條，主要涉及酶結合（Enzyme Binding）、類固醇結合（Steroid Binding）等。見圖5～7。

2.6 KEGG結果分析 利用DAVID在線數據庫對固本止崩湯作用于功能失調性子宮出血的有效作用靶點進行KEGG通路富集分析。以P<0.05和FDR<0.05為篩選標準，取排名前20條通路，以表格形式展示。靶基因主要富集在癌癥通路等信號通路上，固本止崩湯可能通過以上通路參與治療功能失調性子宮出血。見表2。

3 討論

功能失調性子宮出血在中醫學上屬于“崩漏”范疇，多是由于經血失調、沖任二脈受損所致[10]。脾腎虧虛，致陰陽失衡、氣血失調，氣不攝血，易導致崩漏。因此在治療原則上應補腎健脾，固沖攝血。固本止崩湯具有補腎健脾、益氣攝血的功效，且在臨床中常用于治療崩漏患者[5]，療效較好。血為氣之母，氣有所依，氣旺血生，現代研究表明，黃芪能夠增強骨髓造血能力，改變血液流變學[11]，為各種貧血的治療提供理論依據。肖曉玲[12]觀察56例固本止崩湯治療氣虛型功能失調性患者，總有效率94.64%，說明固本止崩湯治療功能失調性子宮出血療效顯著，值得在臨床中推廣和應用。

通過篩選得到固本止崩湯中的活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、人參皂苷、β-谷甾醇、山柰酚、異鼠李素等，說明以上活性成分可能是固本止崩湯治療功能失調性子宮出血的物質基礎。通常認為下丘腦-垂體-卵巢軸的調節機制失調是功能失調性子宮出血最主要的發病原因[13]，槲皮素可以降低下丘腦-垂體-卵巢軸中雌激素受體（Estrogen Receptor，ER）α，ERβ和孕激素受體（Progesterone Receptor，PR）的表達，從而調節血清中促卵泡激素和黃體生成素水平的分泌[14]，促進卵巢功能和月經周期的恢復，減輕功能失調性子宮出血患者的臨床癥狀。人參皂苷可以通過調節Bax/Bcl-2相關因子的表達，作用于子宮內膜上的孕激素受體，激發孕激素受體的活性[15]，從而控制出血。說明固本止崩湯可以通過多成分調節激素水平的分泌，促進卵巢功能的恢復，緩解功能失調性子宮出血患者的臨床癥狀。

本研究通過構建PPI網絡圖，篩選得到固本止崩湯治療功能失調性子宮出血的核心靶點主要有IL6、VEGFA、TP53、TNF、EGF、MAPK1、JUN、EGFR、ESR1、MAPK8等。TNF作為炎癥介質之一，不僅能夠抗腫瘤，還能夠誘導卵細胞凋亡，損傷內皮細胞影響卵巢血供，進而影響激素的分泌[16]，導致經期紊亂和子宮出血，因此抑制TNF炎癥的激活可以有效減少出血量，抑制炎癥反應和促進子宮內膜的修復[17]。EGF和VEGFA作為血管內皮生長因子，可以促進血管內皮細胞生長和血管新生[18]，并且可以修復創面，起到止血的作用[19]。ESR1作為雌激素受體靶點，可以有效改善患者的月經周期，促進子宮內膜修復[20]，減少子宮出血量。進一步說明固本止崩湯中治療功能失調性子宮出血具有多成分、多靶點的特點。

GO生物過程治療功能失調性子宮出血主要涉及對缺氧的反應、一氧化氮生物合成的正調節、細胞外空間、細胞外區域、酶結合、類固醇結合等。通過KEGG通路富集分析，靶基因主要富集在癌癥通路等信號通路中。PI3K-AKT信號通路作為經典信號通路，可以通過上調其上游信號因子磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）和抑制其下游信號因子蛋白激酶B（Protein Kinase B，AKT）的表達，調節卵泡的生長發育，改善卵巢功能和調節月經周期[21]，減輕患者出血的癥狀。雌激素受體信號通路及其通路中的基因可以調節下丘腦-垂體-卵巢軸功能，調節雌激素水平，減緩子宮內膜的生長速度[22]，修復創面，從而減少患者的子宮出血量。固本止崩湯可以有效調節患者的雌激素和孕激素水平，降低患者的子宮內膜厚度[5]，減輕患者的子宮出血癥狀，提高患者的生命質量。說明固本止崩湯可以通過多成分、多靶點、多通路治療功能失調性子宮出血。

綜上所述，本文運用網絡藥理學的方法對固本止崩湯治療功能失調性子宮出血的靶點及其潛在作用機制進行了分析與探討，揭示了固本止崩湯可以通過多成分、多靶點、多通路協同作用于功能失調性子宮出血。由以上證實固本止崩湯治療功能失調性子宮出血的作用機制較為復雜，為進一步探討固本止崩湯治療功能失調性子宮出血的機制，仍需要后續的實驗驗證。

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（2020-08-24收稿 本文編輯：蒼寧）