基于微陣列芯片對三子養(yǎng)親湯治療過敏性哮喘的分子作用研究

李欣容 陳魯 刁翰林 吳金勇

摘要 目的：研究三子養(yǎng)親湯治療過敏性哮喘的作用機制。方法：使用GEO2R找到GSE40889芯片的差異基因，利用GCBI數(shù)據(jù)庫制作差異基因熱圖，借助DAVID6.8對差異基因進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，使用Cytoscape構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選核心基因，分析網(wǎng)絡(luò)，再進一步利用Cytoscape的MCODE插件對差異表達基因進行模塊分析。結(jié)果：共查詢有效成分21個，對應(yīng)靶點268個;篩選出213個差異基因，差異表達基因主要富集在膜組織、RNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄翻譯方面等，涉及通過TNF-α、B細胞受體、TGF-β、PI3K/AKT信號通路。得到一個重要模塊，功能主要集中在基因沉默的調(diào)控、蛋白質(zhì)異構(gòu)化、細胞-細胞黏附、病毒過程等方面及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、p53介導的內(nèi)源性凋亡信號通路對DNA損傷的響應(yīng)、DNA模板、宿主對病毒轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等，涉及Notch信號通路、FoxO信號通路、PI3K-AKT信號通路等信號通路。結(jié)論：三子養(yǎng)親湯可能通過TNF-α、B細胞受體、TGF-β、PI3K/AKT信號通路，調(diào)控基因沉默、使蛋白質(zhì)異構(gòu)化，影響轉(zhuǎn)錄翻譯等途徑發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞 微陣列芯片;三子養(yǎng)親湯;過敏性哮喘;分子作用;作用通路;網(wǎng)絡(luò)藥理學

Molecular Mechanism of Sanzi Yangqin Decoction on Allergic Asthma Based on Microarray

LI Xinrong1，CHEN Lu2，DIAO Hanlin1，WU Jinyong2

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）

Abstract Objective：To study the mechanism of Sanzi Yangqin Decoction in the treatment of allergic asthma.Methods：Gene Expression Omnibus 2R（GEO2R） was used to find the differential gene of GSE40889 chip，and Gene-Cloud Biotechnology Information（GCBI） database was used to make the differential gene heat map.DAVID 6.8 was used to conduct Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analyses on the differential gene.Cytoscape was used to construct the network of protein-protein interaction.The core gene was screened out，and the network was analyzed.The module analysis of the differential gene was carried out by the Molecular Complex Detection（MCODE） of Cytoscape.Results：A total of 21 active components were queried，268 corresponding targets were found.A total of 213 differential genes were screened out，which were mainly enriched in membrane tissue，ribonucleic acid（RNA） binding，transcription，and translation，involving signaling pathways of tumor necrosis factor-α（TNF-α），B cell receptor，transforming growth factor-β（TGF-β），and phosphoinositide 3 kinase/protein kinase B（PI3K/AKT）.An important module was obtained，which mainly focused on the regulation of gene silencing，protein isomerization，cell-cell adhesion，virus process，the positive regulation of RNA polymerase II promoter transcription，the response of endogenous apoptosis signaling pathway mediated by tumor suppressor p53 to deoxyribonucleic acid（DNA） damage，DNA template，and the positive regulation of host to virus transcription，involving signaling pathways of Notch，forkhead box O（FoxO），and PI3K-AKT.Conclusion：Sanzi Yangqin decoction may regulate gene silencing，make protein isomerization，and affect transcription and translation through the signaling pathways of TNF-α，B cell receptor，TGF-β，and PI3K/AKT.

Keywords Microarray chip; Sanzi Yangqin Decoction; Allergic asthma; Molecular mechanism; Action pathway; Network pharmacology

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.010

過敏性哮喘（Allergic Asthma，AA）是由一種慢性氣道炎癥，可引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和（或）咳嗽等癥狀，多在夜間和（或）凌晨發(fā)生，氣道對多種刺激因子反應(yīng)性增高。世界變態(tài)反應(yīng)組織白皮書估計全球過敏性疾病的患病率為10%～40%，其中包括3億支氣管哮喘患者[1]。城市兒童哮喘流行病學調(diào)查結(jié)果顯示：在確診的哮喘患兒中50.1%伴有過敏性鼻炎[2]。目前，糖皮質(zhì)激素仍然是治療AA的首選[1]，但是這些治療并不總是完全有效，而且有不良反應(yīng)且容易產(chǎn)生耐藥性。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的進步，治療方案一直在完善，但AA預(yù)后仍不理想，復(fù)發(fā)率高，反復(fù)呼吸道感染史、藥物過敏、被動吸煙接觸史是影響過敏性支氣管哮喘發(fā)生主要危險因素[3]。因此，探索AA的發(fā)病機制和新治療靶點具有重要意義。

隨著微陣列芯片技術(shù)的進步和中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展，為尋找復(fù)雜疾病的潛在靶點和中醫(yī)藥中潛在治療藥物提供了更多的可能性[4]。三子養(yǎng)親湯萊菔子、紫蘇子、白芥子3味中藥組成，具有溫肺化痰，降氣消食之功效。有Meta分析研究表明，三子養(yǎng)親湯聯(lián)合西藥較僅使用西醫(yī)治療方法對哮患者有更好效果[5]。因此研究三子養(yǎng)親湯治療AA的機制，可能對進一步研究AA做出貢獻。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合生物信息學技術(shù)，比較AA患者與正常人的基因芯片數(shù)據(jù)庫，通過對三子養(yǎng)親湯有效成分與AA靶點的網(wǎng)絡(luò)分析，以期進一步探索AA發(fā)病及治療的有效途徑。

1 資料與方法

1.1 分子和靶蛋白的收集與處理 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中查詢紫蘇子、萊菔子、白芥子的成分，篩選條件口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18;檢索其作用靶點，在Uniprot網(wǎng)站中將蛋白名轉(zhuǎn)化成基因名，得到3種中藥的作用靶點。在GEO數(shù)據(jù)庫中以“Allergic Asthma”為關(guān)鍵詞進行檢索芯片，下載與AA相關(guān)的GSE40889基因表達譜。GSE40889由Raedler D等提交，實驗基于Affymetrix的GPL6244平臺。GSE7307數(shù)據(jù)集包括114個樣本集，取其中的45個AA患者樣本和45個正常人樣本。使用GCBI基因大數(shù)據(jù)分析工具對AA的基因芯片進行差異表達分析，分為過敏性哮喘組與正常對照組后，對2組樣本的基因表達進行差異化分析，以P<0.001過濾，取差異表達最明顯的213個基因，經(jīng)篩選去重后，得到過敏性哮喘的疾病靶點。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶蛋白篩選 使用Cytoscape 3.2.1中BisoGenet插件，分別構(gòu)建三子養(yǎng)親湯成分作用靶點與過敏性哮喘的疾病靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI） 網(wǎng)絡(luò)，并通過Merged工具進行合并，對合并后的網(wǎng)絡(luò)使用Network Analyser與CytoNCA工具進行拓撲屬性分析，并以“度”和“介數(shù)”篩選核心靶點網(wǎng)絡(luò)，得到中藥-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)，并繪制熱圖及火山圖。根據(jù)“度”和“介數(shù)”值篩選核心基因，值越高表示基因在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.3 差異基因的富集分析 為了闡明三子養(yǎng)親湯治療過敏性哮喘差異基因的潛在生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細胞組分（Cell Component，CC），利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫將差異表達基因列表導入該數(shù)據(jù)庫進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，從而得到基因的功能水平分析結(jié)果。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫。將三子養(yǎng)親湯治療過敏性哮喘的差異表達基因列表導入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，利用數(shù)據(jù)庫分析基因與生物通路的關(guān)系，從而闡明與三子養(yǎng)親湯治療過敏性哮喘相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 核心靶點的模塊分析 使用Cytoscape 3.2.1的MCODE插件篩選核心靶點中的模塊，根據(jù)所得模塊的Score值對模塊進行篩選，同時在David數(shù)據(jù)庫中對模塊進行GO注釋富集分析與KEGG通路富集分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 靶點收集結(jié)果 共查詢紫蘇子、萊菔子、白芥子3種中藥的有效成分21個，其中萊菔子有效成分2個，紫蘇子有效成分14個，白芥子有效成分2個。見表1。中藥對應(yīng)靶點268個，其中萊菔子有效成分對應(yīng)靶點11個，白芥子有效成分對應(yīng)靶點19個，紫蘇子有效成分對應(yīng)靶點105個。見表2。根據(jù)GPL6244平臺對AA差異基因進行比較可得上調(diào)基因172個，下調(diào)基因18個。見表3。

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心蛋白篩選結(jié)果 核心PPI網(wǎng)絡(luò)共有230個核心節(jié)點、6 919條相互關(guān)聯(lián)的邊。對該網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果如熱力圖及火山圖，熱力圖紅色部分表示上調(diào)基因，綠色部分表示下調(diào)基因;火山圖每個節(jié)點代表一個靶點，節(jié)點越高，代表該基因在此過程中越重要。結(jié)合對核心PPI的拓撲分析確定了10個重要的核心基因，即TP53、MCM2、EGFR、CDK2、FN1、UBC、NPM1、OBSL1、HSP90AB1、SIRT7。見圖1～2。

2.3 差異基因的GO分析結(jié)果 差異基因在生物過程中顯著富集，包括膜組織、對可卡因的反應(yīng)、自噬調(diào)節(jié)、宿主對病毒轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、核苷酸切除修復(fù);細胞組分主要富集在ESC/E（Z）復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、局灶性粘連、細胞-細胞黏附連接細胞、線粒體、細胞質(zhì)等;分子功能主要富集RNA結(jié)合、雙鏈DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等。見表4。

2.4 差異表達基因的KEGG分析 根據(jù)KEGG途徑富集分析，差異基因主要富集在代謝途徑、雌激素信號通路、PI3K-AKT信號通路等。見表5。

2.5 核心靶點的模塊分析 Cytoscape 3.7.0分析出2個重要的模塊。10個核心基因全被包含在該2個模塊里，意味著這2個模塊可能明顯代表著該PPI的生物特征。因此這10個基因被定義為PPI網(wǎng)絡(luò)中的主要節(jié)點。在GO富集分析方面，模塊1主要集中在基因沉默的調(diào)控、蛋白質(zhì)異構(gòu)化、細胞-細胞黏附、病毒過程等方面。模塊2主要富集在RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、p53介導的內(nèi)源性凋亡信號通路對DNA損傷的響應(yīng)、DNA模板、宿主對病毒轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等。在KEGG富集方面，模塊1主要與DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)相關(guān)，模塊2主要富集在細胞周期Notch信號通路、FoxO信號通路、PI3K-AKT信號通路等信號通路。見圖3～4。

3 討論

過敏性哮喘屬中醫(yī)“哮病”“喘病”范疇，發(fā)時治標，平時治本，故本研究中AA限定為發(fā)作期哮病。本研究通過檢索萊菔子、紫蘇子、白芥子3味中藥，共找到21各有效成分，268各對應(yīng)靶點，體現(xiàn)了中醫(yī)藥發(fā)揮作用的復(fù)雜性，與中醫(yī)異病同治、同病異治的理論相吻合。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)三子養(yǎng)親湯具有抗炎、止咳、平喘的藥理作用，臨床上常用于治療支氣管哮喘，作用效果與地塞米松相同[6-7]。方中白芥子辛溫燥烈，善溫化寒痰，利氣散結(jié);紫蘇子辛溫芳香，善降氣消痰，止咳平喘，并有潤腸通便之功，有利于腸中痰濁下降而利肺氣;萊菔子消食導滯，降氣祛痰。亦有學者將三子養(yǎng)親湯方研磨進行三伏貼治療兒童哮喘[8]。

PPI網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜也說明了三子養(yǎng)親湯治療過敏性哮喘的機制復(fù)雜，不同劑量的配伍可能存在不同的主要通路機制。有研究表明，三子養(yǎng)親湯能夠發(fā)揮抗支氣管哮喘的作用，并顯著降低哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中白細胞介素（Interleukin，IL）-5表達量[9]，其機制可能與調(diào)控Th1/Th2平衡失調(diào)有關(guān)，其作用效果與孟魯司特鈉相當[10]。對三子養(yǎng)親湯的化學成分的分析研究證實[11-12]，三子養(yǎng)親湯水煎劑中的脂肪油成分占比最大，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用，同時可促進胸腺進一步產(chǎn)生淋巴細胞，可能是三子養(yǎng)親湯發(fā)揮作用的關(guān)鍵。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)分析，來源于萊菔子及紫蘇子的谷甾醇等小分子成分可能是三子養(yǎng)親湯治療AA的主要化學成分。有實驗證明，β-谷甾醇可提高抗炎因子IL-10的活性，減小趨化因子和炎癥介質(zhì)活性[13]，同時抑制核因子κB遷移，其作用機制是通過減少一氧化氮的合成，抑制巨噬細胞IL-6活性，炎癥介質(zhì)的分泌，實現(xiàn)抗炎作用[14]。分析結(jié)果中，來源于紫蘇子的有效化合物最多，說明紫蘇子是三子養(yǎng)親湯治療過敏性哮喘中最重要的物質(zhì)來源。有研究單用蘇子水提取物與糖皮質(zhì)激素、β受體激動劑、茶堿類藥物比較，發(fā)現(xiàn)紫蘇水體無對于哮喘的療效要明顯好于對照組[15]。有研究顯示，紫蘇子提取物蘇子油可顯著減少小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-6等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，但其對Th1/Th2的平衡無明顯作用[16]。

差異基因的高表達或者低表達是過敏性哮喘發(fā)病的關(guān)鍵點，同時也是三子養(yǎng)親湯治療AA的切入點。從分析結(jié)果來看，結(jié)合現(xiàn)有資料，三子養(yǎng)親湯可能通過TNF-α、B細胞受體、TGF-β、PI3K/AKT等信號通路[17-18]，對細胞膜組織及細胞的轉(zhuǎn)錄翻譯過程產(chǎn)生影響，進而影響蛋白質(zhì)的合成，降低炎癥介質(zhì)釋放，進而達到降低氣道高反應(yīng)以及抗炎的作用[19];同時，三子養(yǎng)親湯可降低炎性細胞的黏附連接、影響RNA與DNA過程，從而與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，激活自身免疫系統(tǒng)來降低氣道高反應(yīng)[11]。從富集結(jié)果來看，宿主對變應(yīng)原的免疫反應(yīng)是三子養(yǎng)親湯治療過敏性哮喘的關(guān)鍵步驟，主要體現(xiàn)在激活人體本身免疫系統(tǒng)方面，自噬作用以及病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核苷酸切除等調(diào)節(jié)細胞、病毒的生命過程方面。對核心基因的模塊分析標明，三子養(yǎng)親湯可引起基因沉默、影響病原體的繁殖，并且使病原體的蛋白質(zhì)異構(gòu)、降低病原體的黏附能力，從而降低炎癥反應(yīng)。對模塊的KEGG通路富集結(jié)果與核心網(wǎng)絡(luò)的富集結(jié)果相同，進一步證明了結(jié)果的可靠性，證明核心基因可涵蓋整個組方的作用特點。

綜上所述，本研究通過挖掘高通量GEO基因芯片數(shù)據(jù)庫并借助DAVID和string等在線分析工具，挖掘并分析了過敏性哮喘患者與正常人之間的差異基因，并在分析軟件中將三子養(yǎng)親湯的有效成分及其作用靶點與差異基因虛結(jié)合，分析結(jié)果提示三子養(yǎng)親湯主要通過TNF-α、B細胞受體、TGF-β等信號通路參與對細胞膜組織及細胞的轉(zhuǎn)錄翻譯過程產(chǎn)生影響，進而影響蛋白質(zhì)的合成，降低炎癥介質(zhì)釋放，進而達到抗炎的作用。這些研究結(jié)果將為過敏性哮喘的分子靶向治療提供一些指導意義，同時也迫切需要新的實驗研究來驗證本實驗結(jié)果，為治療過敏性哮喘做出更進一步的貢獻。

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（2020-07-05收稿 本文編輯：王明）