降尿酸方對高尿酸血癥腎病大鼠內皮功能的影響

郭亞芳 丁鈴 喬春萍 周嘉寶 李東東 甘靜 張長明 高建東

摘要 目的：探究降尿酸方對氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤造模高尿酸血癥腎病大鼠內皮型一氧化氮合酶（eNOS），內皮素（ET）的影響。方法：將40只8周齡無特定病原（SPF）級雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、別嘌醇組和降尿酸方組。正常組灌胃2 mL/d滅菌蒸餾水，2次/d，模型組采用上午氧嗪酸鉀1 500 mg/（kg·d）聯合腺嘌呤100 mg/（kg·d）灌胃，下午2 mL/d滅菌蒸餾水4周誘導高尿酸血癥腎病模型。別嘌醇組，降尿酸方組，上午與模型組相同。下午別嘌醇組給予大鼠灌胃2.5 mg/100 g劑量別嘌醇灌胃，降尿酸方組給予大鼠灌胃1.6 g/（100 g·mL）劑量灌胃。治療4周后處死，檢測血肌酐（Scr）、血尿酸（SUA）、尿素氮（BUN）。觀察腎功能，電鏡觀察腎臟內皮病變，實時聚合酶鏈式反應技術（Real-time PCR）檢測eNOS mRNA，ET mRNA表達水平。免疫組織化學檢測eNOS、ET的表達。結果：與正常組比較，模型組Scr、SUA、BUN顯著升高（P<0.05），電鏡顯示腎臟內皮細胞損傷嚴重。腎組織eNOS mRNA的表達降低（P<0.05）。腎組織ET mRNA的表達升高（P<0.05）。免疫組織化學顯示eNOS表達下降，ET-1表達升高。與模型組比較，別嘌醇組和降尿酸方組Scr、SUA、BUN降低（P<0.05），電鏡顯示大鼠腎臟內皮損傷改善，腎組織eNOS mRNA的表達升高（P<0.05）。腎組織ET mRNA的表達降低（P<0.05）。免疫組織化學顯示eNOS表達升高，ET-1表達下降。結論：降尿酸方通過促進eNOS基因的表達，抑制ET基因的表達改善高尿酸血癥腎病大鼠內皮功能，達到保護腎臟的目的。

關鍵詞 降尿酸方;內皮功能;高尿酸血癥;高尿酸血癥腎病;大鼠;內皮型一氧化氮合酶;內皮素;中藥

Effect of Jiangniaosuan Prescription on the Endothelial Function of Rats with Uric Acid Nephropathy

GUO Yafang1，2，DING Ling2，QIAO Chunping2，ZHOU Jiabao1，LI Dongdong1，GAN Jing1，ZHANG Changming2，GAO Jiandong1

（1 Department of Nephrology，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Institute of Kidney Disease，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine，Shanghai 201203，China; 2 Shanghai Pudong Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai 201399，China）

Abstract Objective：To study the effects of Jiangniaosuan prescription on endothelial nitric oxide synthase（eNOS） and endothelin（ET） in rats with hypoxanthine and adenine-induced uric acid（UA） nephropathy.Methods：Forty 8-week-old male SD rats of SPF grade were randomly divided into a normal group，a model group，an allopurinol group，and a Jiangniaosuan prescription group，with 10 rats in each group.The normal group was given 2 ml/d acidified water by gavage twice a day.All groups were given hypoxanthine 1 500 mg/（kg·d） and adenine 100 mg/（kg·d） in the morning for 4 weeks except the normal group.The model group was given 2 mL/d acidified water by gavage in the afternoon for 4 weeks.The allopurinol group was given allopurinol（2.5 mg/100 g） by gavage in the afternoon.The Jiangniaosuan prescription group was given Jiangniaosuan prescription 1.6 g/（100 g·mL） by gavage in the afternoon.The rats were sacrificed after 4-week treatment，and the serum creatinine（Scr），blood urea nitrogen（BUN），and UA were detected.The renal function of rats was observed，and the renal endothelial lesion was measured by electron microscopy.Real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time PCR） was used to determine the expression levels of messenger ribonucleic acid（mRNA） of eNOS and ET.The expressions of eNOS and ET were detected by immunocytochemistry.Results：Compared with the normal group，the Scr，serum uric acid（SUA），BUN，and UA of rats in the model group were significantly increased（P<0.05），and the cells of renal endothelium were severely damaged.The mRNA expression of eNOS in the kidney tissue was decreased（P<0.05），and the mRNA expression of ET in the kidney tissue was increased（P<0.05）.The results of immunocytochemistry showed that eNOS expression decreased，whereas ET-1 expression increased.Compared with the model group，the Scr，BUN，and UA of rats in the allopurinol group and the Jiangniaosuan prescription group were decreased（P<0.05），and the renal endothelial function was improved.The mRNA expression of eNOS in the kidney tissue was increased（P<0.05），and the mRNA expression of ET in the kidney tissue was decreased（P<0.05）.The results of immunocytochemistry showed that eNOS expression increased，whereas ET-1 expression decreased.Conclusion：Jiangniaosuan prescription improved the endothelial function of rats with UA nephropathy by promoting the expression of eNOS gene and inhibiting the expression of ET gene，thus protecting the kidney.

Keywords Jiangniaosuan prescription; Endothelial function; Hyperuricemia; Uric acid nephropathy; Rats; Endothelial nitric oxide synthase; Endothelin; Chinese medicine

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.012

1990—2017年，全球慢性腎臟病患者病死率增加了41.5%，2017年記錄的全球慢性腎臟病患者達到6.97億，全球患病率達9.1%[1]。越來越多的研究發現，內皮功能障礙，不僅是慢性腎臟病的一個早期預測因子，還是慢性腎臟病的發病機制中的重要因素，更是慢性腎臟病病情進展的預測因子。臨床研究發現，患者血尿酸水平的升高與內皮功能障礙相關[2]。長期的高尿酸血癥導致尿酸鈉結晶沉積在腎髓質、腎間質組織，激活腎臟局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統，進一步損傷內皮細胞。導致腎小球處于高壓力、慢性炎癥反應、間質纖維化等病理學改變是慢性尿酸鹽腎病發病機制。尿酸通過誘導血管內皮細胞表型轉變，誘導氧化應激和糖被脫落導致內皮功能障礙[3]。而一些針對尿酸治療臨床研究發現患者尿酸改善的同時，內皮功能也得到恢復，指導一些血管性疾病的預后[4]。當今動物實驗及臨床試驗均已經發現高尿酸血癥患者伴有不同程度的內皮功能障礙[5]。內皮功能改善被認為是慢性腎臟病預后的一個關鍵指標[6-7]。隨著人們經濟水平的改善，高尿酸血癥已成為我國僅次于糖尿病的第二大代謝性疾病，高尿酸血癥腎病也逐漸出現，給慢性腎臟病診治帶來了新的挑戰[8]。

前期臨床研究發現降尿酸方對高尿酸血癥腎病患者可以降低其肌酐及尿酸[9]。本文在前期研究的基礎上進一步觀察其對高尿酸血癥腎病大鼠組織內皮型一氧化氮合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS）、內皮素（Endothelin，ET）的作用，探討其對腎臟內皮功能的保護作用，了解其保護腎臟的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用8周齡無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級雄性SD大鼠40只，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物許可證證號：SYXK（滬）2014～0006，動物實驗倫理許可號：PZSHUTCM190315030。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心3樓，恒溫（25 ℃）、12 h光照（12 h光/暗循環）、恒濕（45%左右相對濕度）的環境中，自由飲水（蒸餾水），飲食。代謝籠每周清理2次。適應性喂養7 d。如未見發病及發育異常，符合條件，可以實驗。

1.1.2 藥物 降尿酸方藥物組成：王不留行10 g、白芥子10 g、車前子15 g（包）、粉萆薢10 g、生山楂10 g、威靈仙15 g、制大黃10 g。中藥飲片由上海康橋中藥飲片有限公司提供。水煎濃縮，藥物配制好后置于-20 ℃冰箱中分裝保存，臨用前恢復至室溫備用。別嘌醇膠囊（黑龍江澳利達奈德制藥有限公司，批號：H20041338）250 mg/粒。

1.1.3 試劑與儀器 肌酐測定試劑盒（貨號：1845）、尿酸測定試劑盒（貨號：1885），均購于世諾臨床診斷制品（上海）貿易有限公司;RIPA裂解液（碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013B）;ChamQTM SYBR qPCR Master Mix（通用型高靈敏度染料法定量PCR檢測試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：Q341-02）。ET-1抗體（貨號：ab2786）、eNOS抗體（貨號：ab76198），均購于英國Abcam公司。透射電子顯微鏡（FEI公司，德國，型號：Tecna G2BioTWIN），臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：TDL-5），多用途高效離心機（Beckman公司，美國，型號：Avanti J-E）。全自動生化分析儀（Beckman公司，美國，型號：AU5800），海爾冰箱（海爾公司，型號：BCD-215KA），-80 ℃超低溫冰箱（SANYO公司，日本，型號：MDF-U53V），熒光定量PCR儀（ABI公司，美國，型號：SteP One Plus），組織勻漿器（上海凈信科技發展有限公司，型號：JX-FSTPRP-24），普通藥物天平（上海醫療器械八廠，型號：JPT-5）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 40只8周齡雄性SPF級SD大鼠隨機分為正常組（A）、模型組（B）、別嘌醇組（C）、降尿酸方組（D），每組10只。除正常組上午以滅菌蒸餾水1 mL/（100 g·d）灌胃，其余3組以氧嗪酸鉀150 mg/（100 g·d）聯合腺嘌呤10 mg/（100 g·d）灌胃4周誘導高尿酸血癥腎病模型。

1.2.2 給藥方法 正常組：滅菌蒸餾水灌胃2 mL/次，2次/d。模型組：上午氧嗪酸鉀1 500 mg/（kg·d）聯合腺嘌呤100 mg/（kg·d）灌胃，1次/d，下午滅菌蒸餾水灌胃2 mL/次，1次/d，灌胃時間間隔4 h以上。喂養4周誘導高尿酸血癥腎病模型。別嘌醇組和降尿酸方組，上午與模型組灌胃相同。下午別嘌醇組給予大鼠灌胃2.5 mg/100 g劑量別嘌醇灌胃，降尿酸方組給予大鼠1.6 g/（100 g·mL）劑量灌胃。

1.2.3 檢測指標與方法 治療4周后處死。處死大鼠當天腹主動脈抽取大鼠動脈血，將動脈血注入促凝管中，計時靜置2 h后，離心（3 000 r/min，有效離心半徑10 cm）15 min，分離血清，保存，測血肌酐（Serum Creatinine，Scr）、血尿酸（Serum Uric Acid，SUA）、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）。處死后立即在腎動脈和腎靜脈出入處摘取腎臟，取1/2左腎1 mm×1 mm×1 mm的腎間質組織，每個腎組織取3～4塊1 mm3標本放于盛有固定液小瓶中，4 ℃避光保存行電鏡觀察腎臟內皮病變。每組隨機選取3只大鼠摘取腎組織，每個腎組織分為4片，將腎組織置于去酶EP管，實驗室放-80 ℃冰箱儲存，實時聚合酶鏈式反應法檢測eNOS mRNA，ET mRNA表達水平，免疫組織化學法檢測eNOS和ET的表達。基因及引物序列見表1。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩獨立樣本采用獨立樣本t檢驗（Independentsample t-test），多樣本使用單因素方差分析（One-way ANOVA）。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎功能的改變 腎功能結果提示：模型組Scr、SUA、BUN與正常組比較均明顯增高（P<0.05），與模型大鼠比較，降尿酸方和別嘌醇能降低大鼠Scr、SUA和BUN水平（P<0.05）。見表2。

2.2 腎臟電鏡的變化 腎臟電鏡顯示正常組：內皮細胞于血管內膜下排列較緊密，形態較一致。模型組：內皮細胞水腫，呈現泡沫樣改變，部分內皮細胞脫落，且基底膜厚度增厚。中藥組及別嘌醇組內皮細胞腫脹改善，排列整齊，形態規則，血管壁厚度等較模型組有不同程度的改善。各組大鼠腎臟電鏡表現見圖1。

2.3 各組大鼠腎組織中eNOS，ET mRNA的表達?? 與正常組比較，模型組eNOS mRNA表達量減少（P<0.05）;與模型組比較，別嘌醇組和降尿酸方組eNOS mRNA表達量增多（P<0.05）;與正常組比較，模型組ET mRNA表達量增多（P<0.05）;與模型組比較，別嘌醇組和降尿酸方組ET mRNA表達量減少（P<0.05）。見表3。

2.4 免疫組織化學法檢測腎臟eNOS、ET-1的定位和表達 免疫組織化學發現正常組中見腎小管上皮、腎小球中有棕黃色沉積，以胞質中為主，腎間質未見表達。與正常組比較，模型組的eNOS表達在腎小管上皮細胞，腎小球表達減少，胞質中呈棕黃色染色顆粒明顯減少，模型組腎小管管腔變大，不規則。與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組細胞質中呈棕黃色染色顆粒明顯升高。見圖2。

免疫組織化學法發現正常組腎小管基底膜區、腎小管腔內、胞質有均有表達，與正常組比較，模型組在腎小管基底膜區、腎小管腔內、細胞質有大面積棕黃色染色，腎小管間質亦有少量染色，間質模糊不清。模型組腎小管管腔變大，不規則。與模型組比較，別嘌醇組和降尿酸方組腎臟沉積較模型組弱，模型組，別嘌醇組和降尿酸方組均可見腎小管基底膜區、腎小管腔內、細胞質均有明顯的ET-1沉積，腎間質亦有少量沉積。與正常組比較，模型組表達強于正常組、別嘌醇組和降尿酸組;與模型組比較，別嘌醇組和降尿酸組表達較模型組減弱。見圖3。

3 討論

不同類型的腎損害發展成為進展型腎衰竭顯著的病理學變化除了腎臟血管的改變就是伴隨的內皮功能障礙。說明在慢性腎臟病的治療環節中我們應重視患者內皮功能障礙的治療[10]。有研究對我國大陸2000—2014年的流行病學調查研究發現，高尿酸血癥的總體患病率達到13.3%[11]。而持續的高尿酸血癥導致尿酸鹽結晶沉積在腎髓質和腎間質組織，通過激活局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統，氧化應激，損傷內皮細胞，引起腎臟等一系列的炎癥及腎臟纖維化等病理學變化，最終形成高尿酸血癥腎病[12-16]。作為腎臟濾過屏障之一的內皮細胞，最先感受尿酸帶來的腎損害。導致腎臟屏障功能受損，炎癥等進一步腎損傷。故腎臟內皮細胞功能的完善和健全對腎臟，乃至全身的血管系統都有很大影響[17]。

當今的臨床和實驗研究均證明尿酸可以引起內皮細胞損傷，引起內皮功能紊亂。具體機制有以下幾種：1）嘌呤代謝為尿酸時同時生成了大量的活性氧（ROS），ROS通過氧化應激的方式對內皮功能損傷。2）高濃度的尿酸（HUA）會減弱eNOS與鈣調蛋白（CaM）之間的結合，從而降低eNOS活性和NO的產生。3）尿酸還可以起內皮細胞表型轉換，上皮-間充質轉化（EMT）或內皮-間充質轉化（EndoMT）直接作用于腎間質，導致纖維化，引起腎損傷等一系列反應最終導致內皮細胞功能紊亂。4）尿酸通過氧化應激導致內皮細胞糖被的脫落，損傷內皮細胞[18]，引起血管內皮細胞凋亡[19]。5）尿酸誘導炎癥反應激活血小板或炎癥介質等使抗凝及纖溶失衡促使內皮細胞功能紊亂[20]。

血管內皮是機體重要的內分泌器官，可分泌多種血管活性物，如NO、ET-1等，NO是血管內皮細胞釋放的主要血管舒張物質，ET是內皮細胞釋放的主要血管收縮物質，也可以介導炎癥反應，促進其他炎癥介質的釋放。二者共同介導體內血管的收縮和舒張功能。NO在體內的主要代謝產物為硝酸鹽和亞硝酸鹽。NO在體內主要由一氧化氮合酶（NOS）合成。由于NO半衰期很短，故針對NO的研究，主要集中在NOS上。目前發現的NOS主要有3類，神經型、內皮型和誘導型。在腎臟結構中，以eNOS為主要表達。eNOS主要分布于腎臟的腎內小動脈、腎小球毛細血管、近端小管、髓袢升支粗段和集合管中。故eNOS的水平變化可以來間接反映腎臟系統內皮功能變化。我們的實驗發現與正常組比較，模型組eNOS mRNA表達水平降低，與模型組比較，降尿酸方組eNOS mRNA表達水平較模型組升高。即經過降尿酸方治療后患者eNOS mRNA表達水平升高。進一步說明尿酸通過抑制eNOS的活性，影響NO的生成，進一步影響內皮功能。降尿酸方通過提高eNOS的水平，改善高尿酸血癥腎病大鼠內皮功能達到保護腎臟的目的。

ET主要存在于血管內皮，是1988年由Yanagisana等[21]首先從豬主動脈內皮細胞中分離出來的。它是內皮細胞合成的最強的縮血管物質。由于缺氧等因素刺激內皮細胞后生成ET-1。血管的ET系統以內皮細胞產生ET-1為主。故血管內皮功能損傷可出現二者分泌失調。綜上可知，別嘌醇和降尿酸方能夠保護高尿酸血癥腎病大鼠腎功能，保護高尿酸血癥腎病大鼠的內皮功能。機制是通過增加高尿酸血癥腎病大鼠腎臟eNOS的表達和降低ET的表達，保護高尿酸血癥腎病大鼠腎臟的內皮功能，達到保護腎臟的目的。

降尿酸方由七味藥物組成：王不留行10 g、白芥子10 g、車前子15 g、威靈仙15 g、粉萆薢15 g、生山楂10 g、制大黃10 g（便秘者改為用生大黃5 g后下）。本方君藥為三子：王不留行、白芥子、車前子。王不留行：性苦，平。功效：活血通經消腫，本方即取其祛痰行血通絡之功;白芥子：性辛，溫。入肺、肝、脾、胃、心包經。功效：利氣豁痰，溫中散寒，通絡止痛。本方取其去皮里膜外之痰，活血通絡之功。車前子：性甘，微寒。入腎、膀胱經。功效：清熱利尿，滲濕通淋，祛痰。本方取其利小便，通腎氣。粉萆薢：性苦，平。入肝、胃、膀胱經。功效：祛風，利濕。本方取其利腎、膀胱之水之功，分清泌濁以清源。威靈仙：性辛、咸，溫。歸膀胱經。功效：祛風除濕，通絡止痛。本方取其除濕通絡止痛之效。生山楂：性酸、甘、微溫。歸脾、胃、肝經。功效：消食健胃，行氣散瘀。本方取其“化血塊，氣塊，活血”。大黃：性苦，寒。歸脾、胃、大腸、肝、心包經。功效：瀉熱通腸，涼血解毒，逐瘀通經。本方取其通二便直達下焦，深入血分，無堅不破，蕩滌積垢。若大便溏薄改為制大黃。諸藥合用，達到活血通絡、化痰降濁之功效。

我們認為高尿酸血癥腎病病因病機為脾腎不足，痰瘀阻絡的本虛標實之癥。治療以利濕泄濁、健脾補腎、活血化瘀之法治療，方藥以降尿酸方加減治療高尿酸血癥腎病，療效好。前期臨床發現其不僅能減輕高尿酸血癥腎病患者腰酸乏力等不適，更能很好地減少患者血肌酐、血尿酸，有很好的腎臟保護作用。本研究發現降尿酸方能夠減少高尿酸血癥腎病大鼠血肌酐、血尿酸。其保護腎臟的機制是通過增加腎臟eNOS的表達，降低腎臟ET的表達來實現的。

本實驗通過電鏡觀察到正常大鼠，腎小球，腎小管，腎間質結構正常，高尿酸血癥腎病大鼠模型組內皮細胞受到明顯損傷，呈現泡沫樣改變，部分內皮細胞脫落，且基底膜增厚。而尿酸性大鼠經過降尿酸方和別嘌呤醇治療后較模型組比較腎臟內皮細胞明顯好轉，排列整齊，窗孔減少，基底膜增厚減輕。進一步PCR基因檢測及免疫組織化學發現降尿酸方能促進eNOS mRNA的表達，抑制ET mRNA的表達。因此我們可以認為，降尿酸方是通過增加促進eNOS mRNA的表達，抑制ET mRNA的表達來改善高尿酸血癥腎病大鼠的內皮功能，達到保護腎臟的目的。

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（2020-05-12收稿 本文編輯：王明）