1 株高產(chǎn)油脂長(zhǎng)孢被孢霉MD-3菌株的誘變育種

程 晗，陳崇藝，朱露露，柴春月

（南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061）

微生物油脂又稱(chēng)為單細(xì)胞油脂，主要是指霉菌、酵母菌、細(xì)菌以及藻類(lèi)等微生物在適當(dāng)?shù)臈l件下利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锏茸鳛樘肌⒌矗o以無(wú)機(jī)鹽在細(xì)胞中產(chǎn)生并貯存在細(xì)胞內(nèi)的甘油酯。微生物油脂的脂肪酸成分較為豐富，許多絲狀真菌能合成具有高附加值的不飽和脂肪酸，如花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、-亞麻酸（-linolenic acid，GLA）等。部分功能性脂肪酸在高等真核生物中具有重要的生物學(xué)效應(yīng)，如ARA是人體必需的脂肪酸，具有卓越的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)保健功能，EPA可防治心血管病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和氣管炎，預(yù)防心律失常和心臟性猝死等，富含GLA的油脂是一類(lèi)保健性油脂，它可預(yù)防糖尿病、癌癥、肥胖癥，同時(shí)具有降血壓、提高機(jī)體免疫力等作用，也可以添加進(jìn)化妝品提高保濕以及抗衰老效果。因此這類(lèi)功能性不飽和脂肪酸對(duì)人類(lèi)健康具有重要意義。

目前研究比較多的產(chǎn)油脂微生物主要以絲狀真菌、酵母菌和藻類(lèi)為主，在這3 類(lèi)微生物中，絲狀真菌以其脂肪酸成分豐富而凸顯優(yōu)勢(shì)。多數(shù)研究結(jié)果表明，野生型絲狀真菌菌株的油脂含量相對(duì)較低，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的條件，因此開(kāi)展以絲狀真菌為研究對(duì)象，進(jìn)行高產(chǎn)油脂菌株的人工選育十分必要。常見(jiàn)的人工育種方法包括雜交育種、誘變育種、基因工程育種和原生質(zhì)體融合，其中，誘變育種不需要探究菌株復(fù)雜的遺傳背景，過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，主要包括物理因子誘變、化學(xué)因子誘變以及復(fù)合誘變育種技術(shù)。劉紅霞對(duì)粘紅酵母（）進(jìn)行低能離子注入誘變、紫外誘變和微波誘變等方法處理，獲得油脂產(chǎn)量為3.10 g/L的突變菌株，比出發(fā)菌株提高了33.05%。羅國(guó)聰?shù)韧ㄟ^(guò)紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變方法處理1 株桔青霉（），最終得到1 株油脂產(chǎn)量為7.10 g/L的突變菌株，較出發(fā)菌株油脂產(chǎn)量提升了84.42%。姚青蔚對(duì)1 株被孢霉屬（sp.）TSM-3菌株進(jìn)行常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變，最終獲得的突變菌株平均脂質(zhì)積累量為5.07 g/L，ARA產(chǎn)量為1.54 g/L，較出發(fā)菌株分別提高了47.8%和84.5%。由此可見(jiàn)通過(guò)誘變育種的方法，能高效地提高產(chǎn)油微生物的油脂產(chǎn)量。

本研究以產(chǎn)油植物及其根圍土壤為樣品，采用蘇丹黑染色法，從中篩選出高產(chǎn)油脂的絲狀真菌，以篩選出的菌株為出發(fā)菌，通過(guò)ARTP誘變技術(shù)處理，獲得突變菌株，并比較其油脂含量和產(chǎn)量的變化。通過(guò)比較原始菌株和突變菌株在發(fā)酵過(guò)程中菌絲形態(tài)、菌絲密度、菌絲長(zhǎng)短等形態(tài)變化，探究其油脂含量和產(chǎn)量提高的影響因素。結(jié)合實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)脂肪酸合成通路中兩個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化情況。旨在為高產(chǎn)油脂的絲狀真菌的人工選育提供有應(yīng)用價(jià)值的菌源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

于2019年在河南南陽(yáng)國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園，分別采集玉米、花生、大豆、油菜植株及其根系土樣品，在南陽(yáng)市鎮(zhèn)平縣油用牡丹基地采集油用牡丹植株及其根系土樣品，將樣品裝入無(wú)菌牛皮紙袋內(nèi)，標(biāo)記采集時(shí)間及地點(diǎn)，封裝后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

葡萄糖、番紅染液、蘇丹黑B、酵母提取物、瓊脂粉北京索萊寶科技有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司；2×SanPCR Mix生工生物工程（上海）股份有限公司；Fungal RNA Kit總RNA提取試劑盒 美國(guó)Omega公司；PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master 上海羅氏制藥有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；Broth種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水合硫酸鎂0.25 g/L，硝酸鉀10 g/L，pH值自然；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸二氫鉀2.4 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，硝酸鉀1 g/L，二水合氯化鈣0.1 g/L，六水合三氯化鐵0.015 g/L，七水合硫酸鋅0.007 5 g/L，五水合硫酸銅0.000 5 g/L，pH值調(diào)至5.5。上述培養(yǎng)基均在115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HNY-2102C型智能恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津歐諾儀器股份有限公司；SPX-160H型智能生化培養(yǎng)箱 寧波揚(yáng)輝儀器有限公司；ARTP誘變育種系統(tǒng) 無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；FA2104型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；JW-2019H型臺(tái)式高速離心機(jī)安徽嘉文儀器裝備有限公司；SGD-IV型還原糖測(cè)定儀山東省科學(xué)院生物研究所；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

參考陳娟等方法，采用植物組織塊分離法對(duì)產(chǎn)油植物中內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化。參考馬治燦方法，從根系土壤樣品中分離產(chǎn)油真菌。

1.3.2 蘇丹黑染色

A液：稱(chēng)取蘇丹黑B 0.3 g溶于100 mL無(wú)水乙醇中，室溫放置1 周，期間經(jīng)常振蕩使其完全溶解；B液：稱(chēng)取16 g苯酚溶于30 mL無(wú)水乙醇，再與100 mL 0.3%十二水合磷酸氫二鈉溶液混合。取A液60 mL與B液40 mL混合，過(guò)濾后即為蘇丹黑染液。挑取少許菌絲于載玻片上，滴加蘇丹黑染液染色20～30 min，二甲苯?jīng)_洗多余染色液，自然風(fēng)干，番紅染液復(fù)染1～2 min，無(wú)菌水沖洗，自然干燥后鏡檢觀察。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 形態(tài)鑒定

將復(fù)篩到的菌株轉(zhuǎn)接于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～7 d，觀察記錄菌株的生長(zhǎng)速度、菌落特征等。采用載玻片濕室培養(yǎng)法（圖1）觀察菌絲顯微結(jié)構(gòu)。

圖1 載玻片濕室培養(yǎng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of slide culture in moist chamber

1.3.3.2 分子鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行菌株基因組DNA的提取。以通用引物ITS1/4擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列，以通用引物NL1/4擴(kuò)增目核糖體大亞基（ribosomal large subunit，LSU）序列，引物如表1所示。PCR總體系為25 μL，包含上下游引物各1 μL，2×SanPCR Mix 12.5 μL，gDNA 1 μL，ddHO 9.5 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選出相關(guān)序列后用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于ITS＋LSU序列的NJ（Neighbor-Joining）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行Bootstrap分析，重復(fù)次數(shù)為1 000 次。

1.3.4 產(chǎn)油菌ARTP誘變育種

1.3.4.1 孢子懸液的制備

將出發(fā)菌株接種到PDA平板上28 ℃培養(yǎng)5～8 d，用15%的無(wú)菌甘油溶液沖洗，并收集沖洗液，經(jīng)4 層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，收集孢子懸液，用無(wú)菌水調(diào)整孢子濃度至10CFU/mL，備用。

1.3.4.2 致死率曲線的制作

將10 μL孢子懸液均勻涂布到ARTP載片上，設(shè)置電源功率110 W，氣流量10 slpm，處理距離2 mm，分別處理0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 s。將處理后的載片分別放入裝有1 mL無(wú)菌水的離心管中充分振蕩混勻，適當(dāng)稀釋后涂布平板，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)2～5 d，統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板上的菌落數(shù)，以0 s處理樣品為對(duì)照，計(jì)算致死率。

選擇致死率為70%～80%的處理時(shí)間多次進(jìn)行ARTP誘變，將處理過(guò)的孢子懸液涂布在含有淺藍(lán)菌素的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d。挑選菌落較大的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化后接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中測(cè)定菌株的油脂產(chǎn)量，挑選出油脂產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行斜面保存，備用。

1.3.4.3 遺傳穩(wěn)定性分析

將篩選得到的高產(chǎn)油脂突變菌株依次連續(xù)傳代培養(yǎng)7 次，測(cè)定各菌株每個(gè)時(shí)代油脂產(chǎn)量，挑選出油脂產(chǎn)量穩(wěn)定的菌株，斜面保存，備用。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

1.3.5.1 生物量的測(cè)定

取50 mL發(fā)酵液中的濕菌體于質(zhì)量的玻璃培養(yǎng)皿中，置于100 ℃的烘箱內(nèi)烘至質(zhì)量恒定，取出自然冷卻，稱(chēng)量培養(yǎng)皿和干菌體總質(zhì)量。菌體生物量計(jì)算如式（1）所示：

1.3.5.2 油脂產(chǎn)量的測(cè)定

采用酸熱法提取微生物油脂并測(cè)定其含量：抽濾發(fā)酵液收集菌絲體，取0.1 g濕菌絲體加入600 μL的4 mol/L HCl溶液，渦旋振蕩1 min后靜置15 min，重復(fù)渦旋5 次。沸水浴30 min，期間渦旋振蕩1 次，冰浴30 min，加入1.2 mL氯仿-甲醇（1∶1，/）溶液，混勻后8 000 r/min離心5 min，吸取氯仿層（最下層）轉(zhuǎn)入2 mL離心管內(nèi)，加入等體積的0.1%氯化鈉溶液，振蕩10 s，5 000 r/min離心2 min，吸取氯仿層轉(zhuǎn)入一支已知質(zhì)量的2 mL離心管中，在通風(fēng)櫥中揮發(fā)氯仿，收集油脂。油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)及油脂產(chǎn)量計(jì)算方法分別如式（2）、（3）所示。

1.3.5.3 發(fā)酵液殘?zhí)菧y(cè)定

采用SGD-IV型還原糖測(cè)定儀測(cè)定。

1.3.5.4 原始菌株與突變菌株菌絲球形態(tài)比較

將菌株接種于PDA平板28 ℃培養(yǎng)5～8 d，刮取孢子接種于種子培養(yǎng)液中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h即為發(fā)酵種子液，將種子液按10%的接種量接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)8 d，觀察菌絲球形態(tài)特征。

1.3.5.5 原始菌株與突變菌株搖瓶發(fā)酵過(guò)程比較

采用與1.3.5.4節(jié)相同的發(fā)酵方法搖瓶培養(yǎng)12 d，從2 d開(kāi)始每天取樣測(cè)定菌株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)、生物量以及油脂產(chǎn)量。

1.3.5.6 脂肪酸合成通路相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)

以培養(yǎng)3～7 d菌絲為材料，用Fungal RNA Kit總RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。使用FastStart Universal SYBR Green Master進(jìn)行real-time PCR。real-time PCR所用的引物見(jiàn)表1，選用18S RNA作為內(nèi)參基因。使用Ct法（2）計(jì)算不同基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析及圖形繪制使用Origin 2019b軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)油脂菌株的篩選

2.1.1 初篩結(jié)果

從產(chǎn)油植物及其根系土壤樣品中共分離、純化到140 株真菌，經(jīng)蘇丹黑染色顯微觀察結(jié)果顯示，有39 株菌的菌絲胞內(nèi)呈現(xiàn)黑色油脂滴，推測(cè)這些菌株為產(chǎn)油菌，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2 平板初篩結(jié)果Table 2 Results of plate preliminary screening

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果

將初步篩選獲得的39 株產(chǎn)油菌，利用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，依次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，分別檢測(cè)發(fā)酵液殘?zhí)恰⑸锪俊⒂椭|(zhì)量分?jǐn)?shù)以及油脂產(chǎn)量，結(jié)果顯示，有15 株菌的油脂產(chǎn)量大于1 g/L（表3），其中菌株P(guān)ES-2、MD-3、MDS-1、BES-5的葡萄糖利用率較高，發(fā)酵液殘?zhí)橇慷荚?0%以下；菌株P(guān)ES-2、MD-3、MDS-1、MDS-7、BES-2、RAS-1的生物量較高，均大于14 g/L；菌株P(guān)ES-1、MD-3、MDS-1、MDS-8、BES-2的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在20%以上；菌株MD-3、MDS-1、BES-2的油脂產(chǎn)量均在3 g/L以上。綜合以上指標(biāo)，MD-3菌株的發(fā)酵液殘?zhí)亲畹停锪看笥?4 g/L，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)及油脂產(chǎn)量最高，分別為29.36%和4.35 g/L，因此選擇該菌株作為后續(xù)誘變育種的出發(fā)菌株。

表3 部分復(fù)篩結(jié)果Table 3 Results of partial secondary screening

2.1.3 MD-3的發(fā)酵產(chǎn)油曲線

為了探究菌株MD-3的最佳發(fā)酵產(chǎn)油培養(yǎng)時(shí)間，將該菌株接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)12 d，從2 d開(kāi)始每天取樣測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖2所示，菌株MD-3在第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6～8 d是穩(wěn)定期，之后進(jìn)入細(xì)胞衰亡期。胞內(nèi)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量均從第3天開(kāi)始積累，之后逐步增加。第8天的菌株MD-3的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)和油脂產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別30.15%和4.67 g/L。

圖2 菌株MD-3發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curves of strain MD-3

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株MD-3接種于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，菌落形態(tài)及顯微形態(tài)如圖3所示。菌落呈白色花瓣?duì)睿瑲馍z較短，有特殊腥味。初期產(chǎn)生無(wú)隔菌絲，菌絲內(nèi)有油脂滴，后期產(chǎn)生有隔菌絲。孢囊梗大多從氣生菌絲長(zhǎng)出，囊領(lǐng)小或不明顯，孢子囊為球形，直徑9～13 μm，表面較為光滑，內(nèi)含多個(gè)孢囊孢子。孢子呈橢圓形或圓形，大小為2～4 μm，生長(zhǎng)后期孢子內(nèi)形成油滴。蘇丹黑-番紅染色可以明顯觀察到紅色菌絲內(nèi)部的黑色油脂滴。

圖3 菌株MD-3在PDA平板上的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig.3 Colony morphology and micromorphology of strain MD-3 on PDA plate

2.2.2 分子鑒定

以MD-3菌株的gDNA為模板，分別擴(kuò)增其ITS序列和LSU基因，獲得了長(zhǎng)度為586 bp的ITS序列（MZ150514）和728 bp的LSU（MZ150555）序列，經(jīng)BLAST比對(duì)，該菌株的ITS序列與已報(bào)道的長(zhǎng)孢被孢霉（）對(duì)應(yīng)序列（MT366027）相似性達(dá)100%，LSU序列（MH047197）相似性達(dá)99.73%。結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，推定該菌株為被孢霉屬的長(zhǎng)孢被孢霉。根據(jù)劉澤報(bào)道，挑選相關(guān)菌株的ITS和LSU序列，見(jiàn)表4。

表4 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)所用菌株ITS及LSU序列GenBank編號(hào)Table 4 GenBank number of ITS and LSU strains used to construct phylogenetic tree

續(xù)表4

使用MEGA7.0軟件以為外群構(gòu)建基于ITS＋LSU的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），MD-3菌株與聚在同一分枝，經(jīng)1 000 次Bootstrap檢驗(yàn)同源性為100%。

圖4 菌株MD-3基于ITSLSU序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS and LSU sequences of strain MD-3

2.3 ARTP誘變結(jié)果

2.3.1 誘變處理時(shí)間的確定

為探究不同ARTP處理時(shí)間對(duì)菌株活性影響，分別設(shè)計(jì)不同處理時(shí)間梯度對(duì)MD-3菌株進(jìn)行誘變處理，結(jié)果表明（圖5），隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株MD-3的致死率逐步增高，60 s達(dá)到78%，100 s達(dá)100%。有研究表明，誘變致死率為70%～80%時(shí)，菌株正突變率較高。因此本研究選擇誘變時(shí)間為60 s。

圖5 長(zhǎng)孢被孢霉ARTP誘變致死率曲線Fig.5 Death rate of M.elongata caused by ARTP

2.3.2 淺藍(lán)菌素濃度的確定

淺藍(lán)菌素是一種藍(lán)色頭孢霉（）的代謝產(chǎn)物，它可以特異性地與FAS中的特定部位共價(jià)結(jié)合，形成羥基內(nèi)酰胺環(huán)使該酶失活，而FAS在脂肪酸合成過(guò)程中有著關(guān)鍵作用，因此淺藍(lán)菌素可以抑制生物體內(nèi)脂肪酸的合成，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。目前已有不少研究證明淺藍(lán)菌素篩選高產(chǎn)油脂菌株可行。把誘變后的菌株接種到含有一定濃度淺藍(lán)菌素平板上，只有FAS活性相對(duì)較高的菌株可以存活，且培養(yǎng)基上菌落越大表示菌株的FAS活性越強(qiáng)。將長(zhǎng)孢被孢霉孢子懸液適當(dāng)稀釋后涂布于含有淺藍(lán)菌素濃度分別為0、0.9、1.8、2.7 μmol/L的PDA培養(yǎng)皿上，28 ℃培養(yǎng)48 h，結(jié)果顯示隨著淺藍(lán)菌素濃度的增加，菌株的生長(zhǎng)速度逐漸減慢，且菌落數(shù)量明顯減少，當(dāng)淺藍(lán)菌素濃度為1.8 μmol/L時(shí)，菌株的生長(zhǎng)速度明顯受到抑制，但菌落數(shù)目沒(méi)有明顯減少（圖6c），有利于篩選工作的進(jìn)行，因此本研究確定使用含有1.8 μmol/L淺藍(lán)菌素培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)高產(chǎn)油菌的菌落篩選實(shí)驗(yàn)。

圖6 長(zhǎng)孢被孢霉在不同濃度淺藍(lán)菌素平板上生長(zhǎng)情況Fig.6 Growth of M.elongata on plates containing cerulenin at different concentrations

2.3.3 ARTP誘變結(jié)果

2.3.3.1 淺藍(lán)菌素篩選結(jié)果

將ARTP處理后的突變菌株涂布在濃度為1.8 μmol/L淺藍(lán)菌素平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，平板上長(zhǎng)出大小不一的菌落（圖7），挑選出50 株生長(zhǎng)速度較快、菌落較大的菌株純化培養(yǎng)，分別測(cè)定其油脂產(chǎn)量（圖8），通過(guò)淺藍(lán)菌素篩選性培養(yǎng)基，篩選到的菌株其油脂產(chǎn)量較原始菌株都有不同程度的提高。

圖7 突變菌株在淺藍(lán)菌素平板上的生長(zhǎng)情況Fig.7 Growth of mutant strain on plate containing cerulenin

圖8 淺藍(lán)菌素篩選突變菌株的油脂產(chǎn)量Fig.8 Oil production of the mutant strain selected by cerulenin

2.3.3.2 多輪ARTP誘變結(jié)果

經(jīng)過(guò)多輪ARTP誘變處理，共挑選出320 株突變菌株，經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其生物量，挑選出生物量較高的株菌，進(jìn)一步測(cè)定其油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)和油脂產(chǎn)量。經(jīng)以上處理和篩選，初步獲得10 株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)和油脂產(chǎn)量較高的菌株，如圖9所示。其中菌株MD-3-2、MD-3-5、MD-3-7、MD-3-9的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為41.40%、41.13%、41.69%、43.42%，其油脂產(chǎn)量依次為6.57、6.68、6.62、6.89 g/L。因此挑選上述4 株菌，以油脂產(chǎn)量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察其遺傳穩(wěn)定性。如圖10所示，菌株MD-3-9雖然初始油脂產(chǎn)量最高，但是后續(xù)傳代發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中油脂產(chǎn)量下降明顯，傳代培養(yǎng)過(guò)程中偶有生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象發(fā)生，說(shuō)明突變極大影響了該菌株正常的生理代謝，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)極不穩(wěn)定。同時(shí)發(fā)現(xiàn)菌株MD-3-2和MD-3-5的油脂產(chǎn)量也出現(xiàn)不同程度的下降，說(shuō)明突變也影響了這兩株菌的正常生理代謝。菌株MD-3-7始終維持較高的、穩(wěn)定的油脂產(chǎn)量水平，生長(zhǎng)沒(méi)有受到突變處理的影響，呈現(xiàn)遺傳穩(wěn)定的特性，因此選擇MD-3-7菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

圖9 部分ARTP突變菌株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)及油脂產(chǎn)量比較Fig.9 Comparison of oil contents and yields of some ARTP-induced mutant strains

圖10 突變菌株遺傳穩(wěn)定性比較Fig.10 Comparison of genetic stability of mutant strains

2.4 突變菌株生理特性比較

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

突變菌株與原始菌株菌落形態(tài)及顯微形態(tài)差異如圖11所示。將突變菌株和原始菌株分別接種于PDA平板上28 ℃培養(yǎng)5 d，可以觀察到菌落都呈花瓣?duì)钫归_(kāi)，突變菌株的氣生菌絲更為茂盛，突變菌株生長(zhǎng)速度稍快于出發(fā)菌株，顯微結(jié)構(gòu)總體差異不大，可見(jiàn)突變菌株部分菌絲膨大程度高于出發(fā)菌株（圖11e、f）。該菌株的孢子囊大多從氣生菌絲上生長(zhǎng)出來(lái)，因此突變菌株的產(chǎn)孢能力強(qiáng)于原始菌株。

圖11 突變菌株與原始菌株菌落形態(tài)及顯微形態(tài)差異Fig.11 Differences in colony morphology and micromorphology between mutant and original strains

2.4.2 發(fā)酵菌絲球差異

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，真菌菌絲球的形態(tài)變化會(huì)影響其發(fā)酵過(guò)程中的傳質(zhì)效果，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和氧氣等底物的吸收發(fā)生變化，導(dǎo)致菌株代謝途徑發(fā)生改變，從而對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的積累產(chǎn)生較大的影響。將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)8 d，可觀察到突變菌株與原始菌株的菌絲球形態(tài)發(fā)生了改變，出發(fā)菌株的菌絲球直徑約1.3 cm，菌絲為白色，呈粗纖維絲狀，菌絲較長(zhǎng)，如圖12a所示；相較于出發(fā)菌株，突變菌株的菌絲球直徑維持在1.1 cm左右，菌絲顏色變深，大多呈現(xiàn)絨毛狀，菌絲較短較為粗壯，菌絲密度增加，如圖12b所示。絨毛狀菌絲能更好地傳遞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于菌絲中油脂的積累，因此推測(cè)菌絲球形態(tài)的改變與產(chǎn)油能力提高正相關(guān)。

圖12 原始菌株（a）與突變菌株（b）發(fā)酵過(guò)程中菌絲球形態(tài)Fig.12 Morphological differences in mycelial pellets between original strain (a) and mutant strains (b) during fermentation

2.4.3 搖瓶發(fā)酵過(guò)程比較

將出發(fā)菌株與突變菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測(cè)其油脂產(chǎn)量的變化，發(fā)現(xiàn)兩種菌油脂產(chǎn)量的走勢(shì)基本相同，在3～6 d菌株油脂產(chǎn)量增長(zhǎng)迅速，到第8天達(dá)到最大值，此后逐步衰減，在這個(gè)過(guò)程中，突變菌株油脂產(chǎn)量始終高于原始菌株（圖13）。比較兩株菌的生物量動(dòng)態(tài)變化結(jié)果顯示，兩株菌生物量變化差異不明顯，3～4 d增長(zhǎng)最為迅速，符合對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)特點(diǎn)，到第8天左右達(dá)到最大值，此后進(jìn)入衰亡期菌絲逐步自行溶解。突變菌株的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)一直高于原始菌株，說(shuō)明誘變改變了菌株的油脂合成能力，致使其油脂產(chǎn)量提高。

圖13 原始菌株與突變菌株搖瓶發(fā)酵過(guò)程比較Fig.13 Comparison of shake flask fermentation process between original and mutant strains

2.4.4 脂肪酸合成通路關(guān)鍵基因表達(dá)量檢測(cè)

ACC是一種具生物素酶I類(lèi)型的催化酶，在脂肪酸合成反應(yīng)中參與第1步反應(yīng)，主要作用是催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸合成過(guò)程中的限速酶。FAS是脂肪酸合成反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。有研究表明過(guò)表達(dá)ACC等相關(guān)脂肪酸合成通路基因可以提高油脂產(chǎn)量。為探究突變菌株中相關(guān)基因表達(dá)量的變化，本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道高山被孢霉中和基因研究結(jié)果，采用同源比對(duì)法，結(jié)合長(zhǎng)孢被孢霉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（GCA_001651415.1），獲得和編碼基因序列，設(shè)計(jì)real-time PCR引物，進(jìn)行表達(dá)量的檢測(cè)，如圖14所示，在突變菌株中基因表達(dá)量上調(diào)到9.25 倍，基因表達(dá)量上調(diào)到4.37 倍。因此推測(cè)突變菌株中脂肪酸合成通路相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，與其油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量的提高正相關(guān)。

圖14 野生型和突變型菌株ACC和FAS的相對(duì)基因表達(dá)水平Fig.14 Relative gene expression levels of acetyl CoA carboxylase and fatty acid synthase in wild-type and mutant strains

3 討論

當(dāng)前運(yùn)用于工業(yè)化生產(chǎn)微生物油脂的菌株種類(lèi)較為單一，因此選育出更多生長(zhǎng)狀況良好的高產(chǎn)油脂菌株具有重要的應(yīng)用意義。本研究從產(chǎn)油植物上分離得到1 株產(chǎn)油脂絲狀真菌，經(jīng)分子鑒定和形態(tài)觀察，確定為長(zhǎng)孢被孢霉，初步檢測(cè)其油脂產(chǎn)量為4.67 g/L。為進(jìn)一步提高菌株油脂產(chǎn)量，本研究運(yùn)用ARTP誘變技術(shù)，基于淺藍(lán)菌素抗性篩選法，快速篩選到1 株遺傳性能穩(wěn)定的突變菌株，經(jīng)自然搖瓶發(fā)酵測(cè)得其油脂產(chǎn)量為6.62 g/L，菌株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.69%，相較于出發(fā)菌株分別提升了41.76%、38.27%。張鵬等分離鑒定了1 株可直接利用預(yù)處理后的稻草秸稈進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)油脂長(zhǎng)孢被孢霉PFY菌株，在適宜條件下發(fā)酵后油脂得率為8.15%。賴(lài)睛等進(jìn)一步采用限氮補(bǔ)料發(fā)酵的方法，將該菌株的油脂的產(chǎn)量提高了521.74 mg/L。Nisha等研究了發(fā)酵條件對(duì)高山被孢霉（）CBS 528.72產(chǎn)油能力的影響，在最優(yōu)條件下，菌株的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.6%，油脂產(chǎn)量為2.83 g/L。張可可等報(bào)道了1 株產(chǎn)油脂的近玫色鎖擲孢酵母（），其油脂產(chǎn)量為3.3 g/L。本實(shí)驗(yàn)選育的高產(chǎn)油脂突變菌株較同類(lèi)菌株具有油脂產(chǎn)量高的特點(diǎn)。突變菌株的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升從而使其總體油脂產(chǎn)量提升，進(jìn)一步探究菌株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升原因，發(fā)現(xiàn)突變菌株ACC和FAS的表達(dá)水平明顯高于原始菌株，因此初步推測(cè)ACC和FAS的表達(dá)水平對(duì)該菌株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量正相關(guān)。本研究主要運(yùn)用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)油脂的發(fā)酵培養(yǎng)，后續(xù)還需要通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)一步提升油脂產(chǎn)量。