血清TSP-1、VEGF及TSP-1/VEGF與早發型重度子癇前期發病的相關性及預測的臨床價值

李 方 韓秋峪 孫禮強 林小滿

早發型重度子癇前期(early onset severe preeclampsia，EOSP)在妊娠34周前發病，有較高的母兒病死率[1]。Raymond等[2]研究表明EOSP是妊娠早期胎盤功能受損引起的更嚴重的表型，各種胎盤源性的損傷因子釋放進入母體血液循環。根據血管內皮細胞損傷學說，母體血液循環中促血管生成因子及抗血管形成因子失衡可導致PE的發生。

血管內皮生長因子(vascular endothlial growth factor，VEGF)是重要的促血管生成因子，在胎盤血管生成重塑以及滋養細胞浸潤分化增生等方面具有重要作用。血小板反應蛋白(thrombospondin-1，TSP-1)是新生血管內源性抑制物，在胚胎發育及血管形成過程中發揮重要作用。目前在子癇前期(preeclampsia，PE)的大多數研究認為，PE患者TSP-1值高于正常孕婦，而極少數研究表明TSP-1值低于正常孕婦[3～5]。多項研究發現PE孕婦血清及胎盤中VEGF表達低于正常孕婦，而極少數研究表明VEGF表達高于正常孕婦(均有缺氧刺激有關)[6～8]。本研究通過研究孕婦血清TSP-1、VEGF在EOSP的表達變化，探討TSP-1、VEGF、TSP-1/VEGF與EOSP發病的相關性，探討妊娠中期血清TSP-1、VEGF及TSP-1/VEGF對EOSP的預測價值。

對象與方法

1.研究對象：選取2019年8月～2020年8月筆者醫院收治的EOSP孕婦38例為病例組，同期門診正常產檢的妊娠28～33+6周健康孕婦40例為對照組?；仡櫺赃x取2018年9月～2020年8月在筆者醫院行中期唐氏篩查并分娩的孕婦90例為驗證組(其中妊娠結局為EOSP孕婦30例為EOSP組，正常分娩孕婦60例為非EOSP組)。病例組和對照組納入標準：(1)20～45歲中國孕婦。(2)妊娠28～33+6周單活胎。(3)病例組符合謝幸等主編的《婦產科學》第9版EOSP的診斷標準，獲知情同意。排除標準：(1)有糖尿病、慢性高血壓、腎病、冠心病等各種合并癥與并發癥，除妊娠期高血壓疾病外的其他產科合并癥、并發癥。(2)孕期服用阿司匹林、鈣離子拮抗劑、微生物類藥物，妊娠期高血壓疾病經過治療者。本實驗已獲得醫院醫學倫理學委員會審批(倫理審批號：XYFY2020-KL168-01)。驗證組納入標準：(1)在筆者醫院行中期唐氏篩查(妊娠15～20+6周)的單胎孕婦同時保留血清保存在筆者醫院產前診斷中心實驗室。唐氏篩查結果均提示低風險。(2)在筆者醫院分娩或可隨訪妊娠結局。排除標準：唐氏篩查結果提示臨界風險、高風險。其他同病例組和對照組的排除標準。

2.研究方法：病例組在入院當天抽取空腹肘靜脈血5ml室溫靜置1h后3000r/min離心10min，分離血清標記后放-80℃冰箱保存。對照組在門診采血中心收集當天離心后的空腹靜脈血血清500μl放入-80℃的冰箱低溫保存。驗證組取自筆者醫院產前診斷中心實驗室進行中期唐氏篩查保存的血清。離心用TG16W微量高速離心機(山東博科生物產業有限公司)完成，試劑盒購自Bioswamp產品(貨號HM10057，HM100868)，用AMR-100全自動酶標儀(杭州奧盛儀器有限公司)酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組VEGF及TSP-1水平。

結 果

1.一般資料情況比較：病例組BMI高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，兩組在年齡、孕周、孕次、產次比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

2.病例組和對照組TSP-1、VEGF及TSP-1/VEGF血清表達情況比較：病例組血清TSP-1、血清TSP-1/VEGF均比對照組表達水平高，而VEGF比對照組水平低，差異均有統計學意義(P<0.001)，詳見表2。

表2 病例組和對照組TSP-1、VEGF及TSP-1/VEGF血清表達情況的比較

3.ROC曲線確定病例組和對照組血清TSP-1、VEGF及TSP-1/VEGF診斷EOSP的截斷值：AUC分別為0.880、0.984、1.000(P<0.001)，對應最佳理論截斷值是2.44ng/ml、271.21pg/ml、9.13，敏感度、特異性及約登指數對應分別是89.5%、92.5%、100.0%，80.0%、97.4%、100.0%及0.695、0.899、1.000，詳見圖1，表3。

圖1 病例組和對照組TSP-1、VEGF 和TSP-1/VEGF的ROC曲線

表3 病例組和對照組TSP-1、VEGF及TSP-1/VEGF的診斷截斷值、AUC、敏感度、特異性、約登指數、95% CI

4.驗證組TSP-1、VEGF、TSP-1/VEGF血清水平比較：EOSP組TSP-1、TSP-1/VEGF均比非EOSP組高，而VEGF低于非EOSP組，差異有統計學意義(P<0.001)，詳見表4。

表4 驗證組中EOSP組與非EOSP組血清TSP-1、VEGF及TSP-1/VEGF表達情況

5.TSP-1、VEGF、TSP-1/VEGF診斷截斷值預測驗證組：TSP-1/VEGF取值9.13預測驗證組，其敏感度優于TSP-1、VEGF單因子預測，詳見表5。

表5 TSP-1、VEGF、TSP-1/VEGF診斷截斷值來預測驗證組

討 論

EOSP在妊娠34周前發病，起病較早且圍生期后果更嚴重，并發子癇、胎盤早剝、HELLP綜合征、心力衰竭和肺水腫等，導致胎兒宮內窘迫、胎兒死亡，FGR和低出生體重兒無法生存[9]。為了減少不良新生兒和產婦結局，在整個妊娠過程中識別、管理、轉診和密切跟蹤患有EOSP的孕婦至關重要[10]。血管內皮學說認為抗血管生成因子與促血管生成因子比值失衡可致PE的發生。TSP-1在抗血管新生、調節內皮細胞功能作用中極為重要，VEGF可以刺激內皮細胞增殖、遷移、黏附和運動并在胚胎早期參與血管重構、滋養細胞浸潤過程，是促血管生成因子[11,12]。本研究證實TSP-1/VEGF在妊娠過程中處于平衡狀態且趨于穩定值，若打破這種平衡，將可能導致EOSP的發生。Redman[13]提出妊娠8～18周是胎盤形成的關鍵時期。Hoffman等[14]研究表明，在妊娠早中期給予小劑量阿司匹林可有效改善孕婦胎盤病理生理變化。EOSP發病較早，若能在孕早、中期建立EOSP預測方法，采取干預，將明顯改善EOSP母嬰的圍產結局。

TSP-1是TSPs家族的5個成員之一，可調節VEGF生物活性，通過CD36和Fyn誘導細胞凋亡，抑制血管內皮細胞遷移和增殖，通過CD36和CD47抑制一氧化氮通路，起到抗血管新生作用[15]。本研究中病例組血清TSP-1高于對照組，證實了EOSP患者血清中血管活性因子TSP-1的升高可加重EOSP的發生發展，與范徐妃等[4]研究顯示，EOPE患者血清及胎盤組織中TSP-1水平增高相一致。而Ulu等[5]研究表明血清TSP-1在PE中明顯降低。

本研究認為TSP-1在EOSP血清中表達差異可能原因如下：(1)TSP-1的相對分子質量大，結構復雜，其受體多樣化，TSP-1不同的狀態和結構與不同受體結合發揮著不同的作用。(2)TSP-1具有復雜的功能(促血管新生和抑制血管新生功能均有)。(3)研究之間缺乏共識歸因于妊娠病理發病機制的內在差異。VEGF可誘導抗凋亡蛋白Bcl-2表達、誘導產生生存素抑制血管內皮細胞凋亡、上調促衰變因子(DAF)表達、保護血管內皮細胞[16]。本研究表明，血清VEGF的降低可加重EOSP的發生、發展，EOSP組的血清VEGF值明顯低于正常妊娠組，差異有統計學意義，與Adu-Bonsaffoh等[6]研究發現孕婦血清VEGF水平降低相一致，而劉曉丹[17]報道的VEGF在缺氧的情況下產生增加。VEGF在血清及胎盤中表達差異可能原因如下：(1)游離VEGF更準確地反映有效循環VEGF，檢測方法不同造成了結果差異。(2)各研究組取材部位差異以及妊娠病理發病機制的內在差異造成了研究結果的不一致。(3)缺氧狀態下機體可引起代償性VEGF升高。

本研究用ROC曲線確定病例組和對照組妊娠28～33+6周孕婦血清TSP-1和VEGF及TSP-1/VEGF AUC曲線下面積分別為0.880、0.984、1.000(P<0.001)，對應最佳理論截斷值是2.44ng/ml、271.21pg/ml、9.13，敏感度和特異性對應分別是89.5%、92.5%、100.0%和80.0%、97.4%、100.0%，約登指數分別為0.695、0.899、1.000。使用TSP-1/VEGF比單獨使用VEGF或TSP-1檢測EOSP更具有診斷價值。EOSP患者中TSP-1和VEGF比值失衡似乎更能反映EOSP的病情狀況。其作用機制可能是TSP-1-CD47信號軸抑制VEGF和VEGFR2的活化，抑制VEGF介導的對血管內皮細胞，并抑制VEGFR2下游的Akt或Src蛋白激酶,從而抑制了新生血管的生成。

研究顯示，TSP-1在妊娠期高血壓疾病比正常孕婦表達水平高，且風險愈高表達越高[18]。胡建文等[19]研究妊娠結局為輕度和重度PE的患者各15例，同期正常孕婦15例，發現子癇前期患者與正常產婦孕早(11～13周)、中期(20～24周)的血清TSP-1水平比較，差異無統計學意義。本研究驗證組中EOSP組血清TSP-1值為3.12±0.76ng/ml，非EOSP組孕婦血清標本中TSP-1值為2.58(0.98)ng/ml。對比血清中TSP-1值，驗證組中EOSP組血清TSP-1比非EOSP組高表達，差異有統計學意義(P<0.001)。血清TSP-1單因子在妊娠中期可能預測子癇前期的發生。此結論與胡建文等[19]的研究結論存在差異。由于本研究及胡建文等的研究樣本量較少，TSP-1在EOSP患者妊娠中期血清中的表達情況與同孕周妊娠女性血清中的表達情況是否存在差異，仍需開展大樣本量進行前瞻性研究予以證實。本研究中驗證組中EOSP組血清VEGF值為237.20±74.23pg/ml，非EOSP組孕婦血清VEGF值為317.61±56.45pg/ml，EOSP組比非EOSP組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.001)，提示VEGF單因子在妊娠中期可能預測子癇前期的發生。

本研究使用TSP-1、VEGF及TSP-1/VEGF的最佳診斷截斷值2.44ng/ml、271.21pg/ml、9.13預測驗證組，敏感度分別為70.00%、66.67%、90.00%，特異性為41.67%、90.00%、70.00%，符合率為51.11%、82.22%、76.67%。本研究得出TSP-1/VEGF檢測取最佳截斷值9.13預測驗證組，其預測的敏感度明顯優于TSP-1、VEGF的單因子預測，檢測妊娠中期血清TSP-1/VEGF，其取值9.13可能對預測EOSP具有一定的價值，效果優于TSP-1、VEGF單因子檢測。

綜上所述，使用TSP-1/VEGF診斷截斷值檢測EOSP，比單獨使用VEGF或TSP-1更具有診斷價值。血清TSP-1/VEGF診斷截斷值9.13，在妊娠中期對預測EOSP有一定的意義。鑒于不同文獻對于TSP-1、VEGF在子癇前期患者血清中的表達存在異議，本研究TSP-1、VEGF及TSP-1/VEGF指標在EOSP的預測存在一定的局限性，以上結論仍需今后開展深入研究予以進一步驗證。