慢肝養(yǎng)陰膠囊對酒精性肝炎大鼠肝組織Caspase-3及PTP1B表達的影響及相關性研究*

侯麗，韓偉

（1.內蒙古巴彥淖爾市醫(yī)院消化科，巴彥淖爾 015000；2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中醫(yī)科，呼和浩特 014030）

酒精性肝?。ˋLD）是因長期大量飲酒所引起的肝臟疾病[1]。初期表現(xiàn)為脂肪肝，進而可發(fā)展成為酒精性肝炎和酒精性肝硬化，嚴重酗酒可誘發(fā)廣泛的肝組織細胞壞死甚至引起肝功能衰竭[2]。慢肝養(yǎng)陰膠囊的處方由北沙參、麥冬、地黃、枸杞子、川楝子、當歸、五味子、黨參、桂枝、人參組成，內容物為棕色粉末，味微苦。功能主治為養(yǎng)陰清熱，滋補肝腎，用于遷延性肝炎、慢性肝炎、肝炎后綜合癥。研究表明慢肝養(yǎng)陰膠囊對大鼠四氯化碳肝損害具有保護作用[3]，對于抗結核藥物所致肝損害具有良好的預防作用[4]。本研究通過實驗觀察慢肝養(yǎng)陰膠囊對酒精性肝炎大鼠模型的影響，為慢肝養(yǎng)陰膠囊在臨床上用于治療酒精性肝炎提供實驗研究基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠50只，SPF級，雄性，體質量 180～220 g，許可證號：SCXK（蒙）2020-0001，購于內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心。實驗大鼠于內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號：SYXK（蒙）2020-0003。飼養(yǎng)條件：溫度 20～25℃，濕度40%～50%，自由飲食飲水。飼料經輻照消毒處理。

1.2 藥品和試劑 慢肝養(yǎng)陰膠囊，規(guī)格：0.25 g/粒，60粒/盒。用法用量：口服，每次4粒，每日3次。國藥準字Z52020175，貴州威門藥業(yè)股份有限公司。多烯磷脂酰膽堿膠囊，規(guī)格：228 mg×36粒，每日3次，每次1粒，國藥準字H20059010，賽諾菲（北京）制藥有限公司。天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒，批號：20191219；γ-谷氨?；D肽酶（γ-GT）試劑盒，批號：20200127；超氧化物歧化酶（SOD）批號：20200312；丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫試劑盒，試劑批號：20200119，以上酶聯(lián)免疫試劑盒購于南京建成生物工程研究所。活化半胱胺酸蛋白酶蛋白-3抗體（Caspase-3）批號：AE031025；蛋白酪氨酸磷酸酶1B抗體（PTP1B）批號：03293306以上抗體均購于北京博奧森生物技術有限公司。TMS-P超敏試劑盒，福建邁新生物技術開發(fā)有限公司，2002215476b。DAB顯色劑，福建邁新生物技術開發(fā)有限公司，批號：2003210031B。磷酸緩沖鹽溶液（PBS），北京索萊寶科技有限公司，批號：20200210。

1.3 實驗儀器 貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀。日本島津UV-2700紫外可見分光光度計。MY2300全自動免疫組化染色機。BX43型顯微鏡，奧林巴斯中國有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物模型的建立及分組給藥 大鼠適應飼養(yǎng)1周，按體質量隨機分為空白對照組、模型對照組、慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組（0.27 g/kg）、慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組（0.54 g/kg）、多烯磷脂酰膽堿膠囊（西藥陽性藥對照）組（0.15 g/kg），每組10只。除了空白對照組外，其他各組均用50%乙醇造模，灌胃體積為12 mL/kg[5-6]。各給藥組灌胃相應藥物，每日1次，10 mL/kg，空白對照組、模型對照組灌胃等體積的蒸餾水。造模同時給藥16周。隔夜禁食，次日腹腔內注射0.3%戊巴比妥鈉溶液按10 mL/kg麻醉，取靜脈血，分離血清，按試劑盒說明操作檢測血清AST、γ-GT。取肝組織1 g勻漿后提取上清液，按試劑盒說明操作檢測肝組織中SOD、MDA的活性。取肝左葉用福爾馬林固定，用于蘇木精-伊紅（HE）染色，采用免疫組織化學技術檢測肝組織細胞中Caspase-3和PTP1B的表達。

1.4.2 肝臟組織HE染色 肝臟組織病理切片脫蠟至水，首先采用蘇木精染色，再用1%的鹽酸乙醇進行分化，用0.5%的伊紅液復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明液透明處理兩次，最后采用中性樹膠封片，觀察肝臟組織細胞脂肪變性及炎癥損傷程度。

1.4.3 免疫組化法檢測肝臟組織中Caspase-3和PTP1B的表達 切片脫蠟至水，放入已沸騰的檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中，中檔微波處理10 min，3%H2O2室溫孵育，PBS沖洗3次。10%的山羊血清孵育10 min。然后滴加一抗（Caspase-3抗體稀釋比例為1∶200；PTP1B 抗體稀釋比例為 1∶150），室溫孵育 2 h。PBS緩沖液沖洗。滴加二抗，室溫孵育30 min。磷酸緩沖鹽溶液沖洗。滴加100 μL辣根酶標記的鏈霉素工作液，室溫下孵育30 min。磷酸緩沖鹽溶液沖洗。滴加50 μL新鮮配制的DAB顯色劑，4 min后自來水沖洗，蘇木精復染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片[7-8]。使用Image J軟件檢測圖片光密度值（OD）。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)采用均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，相關性分析采用Pearson相關。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 慢肝養(yǎng)陰膠囊對血液生化指標影響 造模同時給藥16周后，模型對照組大鼠的血清AST和γ-GT比空白對照組的血清AST和γ-GT顯著增加（P＜0.01），與模型對照組相比各給藥干預組血清中的AST和γ-GT比模型對照組顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組的作用呈劑量依賴性，多烯磷脂酰膽堿膠囊組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組作用結果未見顯著性差異，見表1。

表1 慢肝養(yǎng)陰膠囊對血清中AST、γ-GT活力的影響（±s）Tab.1 Effect of Mangan Yangyin Capsules on the activity of AST and γ -GT in serum（±s）

表1 慢肝養(yǎng)陰膠囊對血清中AST、γ-GT活力的影響（±s）Tab.1 Effect of Mangan Yangyin Capsules on the activity of AST and γ -GT in serum（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) 劑量（g/kg） AST（U/L） γ-GT（U/L）空白對照組 10 - 48.24± 6.07 212.62±28.63模型對照組 10 - 109.73±17.62**278.33±20.74**多烯磷脂酰膽堿膠囊組 10 0.15 77.84±16.04## 234.60±25.62##慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組 10 0.27 95.81±10.18# 250.64±18.39#慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組 10 0.54 81.46±11.19## 233.93±21.89##

2.2 慢肝養(yǎng)陰膠囊對肝組織生化指標影響 邊造模邊給藥16周后，模型對照組肝臟中SOD顯著降低（P＜0.01），與模型對照組相比各給藥組肝組織中SOD活性顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。邊造模邊給藥16周后，模型對照組肝臟中MDA顯著增多（P＜0.01），與模型對照組相比各給藥組肝組織中MDA含量顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01），慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組的作用呈劑量依賴性，多烯磷脂酰膽堿膠囊組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組作用結果差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

表2 慢肝養(yǎng)陰膠囊對肝組織中SOD活性和MDA含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Mangan Yangyin Capsules on the content of SOD and MDA in liver tissue（±s）

表2 慢肝養(yǎng)陰膠囊對肝組織中SOD活性和MDA含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Mangan Yangyin Capsules on the content of SOD and MDA in liver tissue（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

MDA（nmol/mL）空白對照組 10 - 196.38±12.64 4.62±0.95模型對照組 10 - 149.36±21.71** 11.15±2.39**多烯磷脂酰膽堿膠囊組 10 0.15 167.85±13.01## 7.05±1.34##慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組 10 0.27 163.94±10.02# 9.42±1.18#慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組 10 0.54 171.27±13.62## 7.51±1.31##組別 動物數(shù) 劑量（g/kg）SOD（U/mg）

2.3 慢肝養(yǎng)陰膠囊對肝臟組織脂肪變性的影響 空白對照組肝細胞排列整齊，結構完整，胞漿染色均勻，無脂肪變性，未見炎性細胞浸潤和細胞壞死特征，與空白對照組對比模型對照組大鼠肝索排列紊亂，肝細胞生腫大，可見有明顯的脂肪空泡和炎細胞浸潤；經16周防治后可見各給藥組存在一定數(shù)量的脂肪空泡，但脂肪空泡和炎細胞浸潤較模型對照組有一定的減輕，見圖1。

圖1 大鼠肝臟組織HE結果（×200）Fig.1 HE results of rat liver tissue（×200）

2.4 慢肝養(yǎng)陰膠囊對Caspase-3和PTP-1B在肝臟組織中表達的影響 造模同時給藥16周后，與空白對照組相比模型對照組肝臟組織中Caspase-3和PTP1B表達顯著增加（P<0.01），與模型對照組相比各給藥組肝組織中Caspase-3和PTP1B表達顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01），慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組的作用呈劑量依賴性，慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組作用優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿膠囊組，但結果見顯著性差異，結果見表3、圖2和3。

表3 各組肝臟組織中Caspase-3和PTP1B表達（灰度值）的比較（±s）Tab.3 Comparison of Caspase-3 and PTP1B expression(gray value)in liver tissue of each group（±s）

表3 各組肝臟組織中Caspase-3和PTP1B表達（灰度值）的比較（±s）Tab.3 Comparison of Caspase-3 and PTP1B expression(gray value)in liver tissue of each group（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) 劑量（g/kg） Caspase-3 PTP1B空白對照組 10 - 0.075±0.028 0.062±0.024模型對照組 10 - 0.199±0.047** 0.218±0.059**多烯磷脂酰膽堿膠囊組 10 0.15 0.164±0.026## 0.165±0.028##慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組 10 0.27 0.161±0.034# 0.175±0.033#慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組 10 0.54 0.155±0.028## 0.153±0.034##

圖2 大鼠肝組織Caspase-3表達的結果（×200）Fig.2 Results of Caspase-3 expression in rat liver tissue(×200)

圖3 大鼠肝組織PTP1B的結果（×200）Fig.3 Results of PTP1B expression in rat liver tissue(×200)

2.5 大鼠血清AST活性與肝臟組織中Caspase-3及PTP1B表達相關性分析 Pearson相關分析顯示大鼠血清中AST的活性與肝臟組織中Caspase-3及PTP1B表達之間具有相關性（r=0.755，r=0.826，P＜0.01），見表 4。

表4 大鼠血清AST活性與肝臟組織中Caspase-3及PTP1B表達相關性分析Tab.4 Correlation between serum AST activity and expression of Caspase-3 and PTP1B in liver tissue of rats

2.6 大鼠血清肝臟組織中Caspase-3與PTP1B表達相關性分析 Pearson相關分析顯示大鼠肝臟組織中Caspase-3與PTP1B表達之間具有相關性（r=0.696，P＜0.01）。

3 討論

酒精性肝病臨床分為脂肪肝、肝炎、肝硬化，常混合存在[9]。酒精主要在肝臟組織中代謝，經過肝臟組織細胞中的乙醇脫氫酶的催化氧化為乙醛，再經過乙醛脫氫酶催化轉成乙酸，最終形成二氧化碳[10]。在酒精的氧化過程中分解出大量的氫離子和輔酶結合，引起依賴還原型輔酶的物質代謝發(fā)生了改變，最終成為物質代謝紊亂和誘發(fā)疾病的基礎[11]。乙醛還對肝臟組織細胞具有直接毒性作用，如影響線粒體產生腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、抑制生物合成蛋白質和排泌以及引起脂肪在肝細胞內蓄積[12]。一次酗醉幾小時后即可發(fā)生肝脂肪變。酒精性肝炎主要表現(xiàn)為血清AST升高，谷氨酸氨基轉移酶（ALT）水平升高不靈敏是因為乙醛使酶的活性輔因子B6下降所引起的[13]。γ-谷氨酰轉肽酶廣泛地分布在人體組織中，腎臟組織中最多，其次是胰腺和肝臟[14]。在肝臟組織中主要分布于胞漿和肝內膽管上皮組織中，血液中γ-GT主要來自肝臟組織[15]。嗜酒會引起肝臟損傷致使血清γ-GT活性升高，酒精損傷肝細胞微粒體時γ-谷氨酰轉肽酶升高較靈敏[16]。本研究結果表明慢肝養(yǎng)陰膠囊可降低酒精性肝炎大鼠模型血清中AST和γ-GT的活力。

SOD，又稱為肝蛋白，可以消除組織在新陳代謝過程中產生的有害物質，還能夠對抗和阻斷氧自由基對細胞造成的損害，并能夠及時修復受損的細胞，抵抗因為自由基造成的細胞傷害[17]。MDA是脂質氧化代謝的終產物，可以影響線粒體關鍵酶的活性。氧化應激性肝損害在酒精性肝病占有至關重要的地位，氧化應激（OS）是體內抗氧化作用與氧化反應的失衡狀態(tài)，傾向于氧化反應，氧化應激能夠引起中性粒細胞的炎性浸潤和白酶分泌增加，從而產生大量的氧化中間產物[18]。本研究結果表明慢肝養(yǎng)陰膠囊可升高酒精性肝炎大鼠模型肝組織中SOD的活性，降低酒精性肝炎大鼠模型肝組織中MDA的含量。

酒精性肝病中由于線粒體功能失調可導致肝細胞的凋亡，Caspase-3活性增加。Caspase-3在細胞凋亡中具有重要的作用，Caspase-3主要的底物是腺嘌呤核苷二磷酸（ADP）-核糖聚合酶，在細胞啟動凋亡時，ADP-核糖聚合酶能夠被Caspase-3剪切成85kD和31kD兩個片段，使ADP-核糖聚合酶中與DNA結合的兩個催化區(qū)域分離，最終使受ADP-核糖聚合酶負調控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶的活性增高，裂解了核小體間的DNA，誘導細胞凋亡[19-21]。本研究結果表明慢肝養(yǎng)陰膠囊可降低Caspase-3在酒精性肝炎大鼠模型肝組織中的表達。

PTP1B廣泛存在于肝組織細胞、脂肪細胞、肌組織細胞和上皮細胞多個組織中，PTP1B主要位于胞漿內質網組織中，參與細胞內的信號轉導，調節(jié)細胞的分化、生長、代謝和基因轉錄等[22]。機體PTP1B活性的升高與胰島素抵抗和非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）均密切相關，通過調控靶點PTP1B可降低肝臟脂質合成、減少三酰甘油在肝細胞中的堆積，也有研究表明長期大量飲酒可增加胰島素抵抗[23-25]。本研究結果表明慢肝養(yǎng)陰膠囊可降低PTP1B在酒精性肝炎大鼠模型肝組織中的表達。

本研究結果表明肝臟組織中Caspase-3與PTP1B表達之間具有相關性，呈正相關，說明酒精性肝炎時線粒體調控能量代謝、細胞凋亡、氧化應激損害等功能的異常和胰島素抵抗共同參與了肝細胞損傷的病理過程。慢肝養(yǎng)陰膠囊可能通過提高機體的抗氧化能力、減輕胰島素抵抗、抗凋亡等途徑對大量飲酒產生的肝損傷起到保護作用。