三焦祛濕方對膜性腎病小鼠腎組織ZO-1和synaptopodin蛋白表達的影響*

陳靜潔 ，方敬 ，趙亞云 ，劉海平 ，，馬赟 ，陳志強

（1.河北中醫學院，河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室，石家莊 050091；2.河北中醫學院第一附屬醫院，石家莊 050011）

膜性腎病（MN）是一種自身免疫性腎小球疾病，診斷依賴于腎穿刺，病理表現主要是腎小球基底膜彌漫性增厚并伴有免疫復合物的沉積。目前已經證實血清抗磷脂酶A2抗體（PLA2R）滴度水平與疾病的活動性具有相關性[1]。發病年齡以中年男性居多，近年來發病人數在逐步攀升[2]。環境污染與MN發病人數的增加密切相關，研究顯示[3]，空氣中PM2.5濃度的增加與患MN的風險之間呈現一定的相關性。臨床上MN患者以大量蛋白尿、水腫為主要表現。大量蛋白尿的產生與足細胞的損傷密不可分，遺傳、藥物等因素會導致足細胞足突融合、數量減少、結構和功能受損，濾過膜通透性發生改變，蛋白漏出而形成蛋白尿[4-5]。足細胞的正常工作依賴骨架蛋白的維系，骨架蛋白主要由中間絲、微管及肌動蛋白微絲構成，每個部分均分布著與足細胞相關的特殊蛋白，其中緊密連接蛋白ZO-1、骨架蛋白synaptopodin即為足細胞相關蛋白，對維持足細胞的結構和功能具有重要意義[6-7]。因此恢復受損的足細胞，改善濾過膜的完整性和通透性對減少蛋白尿保護腎功能作用重大。

在中醫基礎理論指導下，辨證運用中醫藥治療MN在臨床上效果顯著。中醫古籍認為“蛋白質”屬于精微物質，其輸布運行與三焦有著密切的關系。《五臟穿鑿論》曰“腎與三焦相通，腎與命門相通。”據此后代醫家在治療腎臟疾病時多注重調和三焦，補益腎臟。《難經》云：“三焦，水谷之通道，氣之所始終也。”可見三焦是氣血津液正常輸布的重要通道，是聯絡各臟腑的通路。MN患者多病程長久，易導致臟腑虧損，加之近年來人們飲食結構的改變、生活壓力的增加、飲食勞倦等多種因素導致脾無力運化，則易釀生濕邪。三焦祛濕方（黃芪、淫羊藿、丹參、川芎、紅花、水蛭、藿香、陳皮、白豆蔻、積雪草、炒白術、茯苓）具有宣通三焦、活血通絡、祛濕化痰的作用，是陳志強教授根據臨床經驗總結出的治療MN的有效方劑。課題組前期的臨床觀察顯示[8]：宣通三焦、活血通絡法可以顯著降低MN患者的尿蛋白，保護腎功能，延緩疾病的進展。本研究擬通過復制MN動物模型，探討該方可能的腎保護作用機制以及對ZO-1、synaptopodin蛋白表達水平的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雌性Balb/c小鼠60只，體質量16～19 g，6～8周齡，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2016-0006。本實驗方案由河北中醫學院動物倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑 C-BSA（美國Chondrex公司，批號9058）；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，批號F5881）；ALB（血清白蛋白）測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號200923）；Scr（血肌酐）、BUN（尿素氮）、TC（總膽固醇）測定試劑盒（貝克曼庫爾特實驗系統有限公司，批號分別為AUZ3592，AUZ3625，AUZ3611）；ZO-1 抗體、synaptopodin 抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號GB111402、GB111049）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號GB23303、GB23301）；FITC標記的山羊抗小鼠IgG（美國KPL公司）；ACTIN抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號 GB12001）。

1.3 實驗藥物 鹽酸貝那普利片（深圳信立泰藥業股份有限公司，批號H20054771）；三焦祛濕方顆粒劑型：黃芪、淫羊藿、丹參、川芎、紅花、水蛭、藿香、陳皮、白豆蔻、積雪草、炒白術、茯苓（廣東一方制藥有限公司，批號分別為：012263，010049，101123，101149，101149，012028，004636，012165，009644，011590，011271，012347）。

1.4 實驗儀器 7170A型全自動生化分析儀（Hitachi公司）；BX43型免疫熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；BX51型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；雙垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；Image Quant LAS4000型化學發光成像分析儀（美國GE Healthcare公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 造模60只小鼠測定24 h尿蛋白定量（24 h-UTP）均小于 22 μg。隨機分組，給予小鼠尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）進行建模[9]。預免疫：造模組給予0.2 mg C-BSA與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后多點位皮下注射；對照組用等體積的弗氏完全佐劑多點位皮下注射。2周后，正式免疫：造模組給予小鼠尾靜脈注射CBSA（6.5 mg/kg），隔日 1次，持續 6周；對照組尾靜脈注射生理鹽水代替，余操作相同。實驗8周后，造模組小鼠共死亡6只，造模組余下的小鼠測24h-UTP均大于60 μg，提示造模成功[10]。造模組小鼠隨機選取4只做腎組織免疫熒光檢查，均觀察到免疫復合物沿毛細血管壁呈顆粒樣沉積，證實MN造模成功。然后將造模組剩余的40只小鼠隨機分為4組，模型組（10只）、中藥低劑量組（10只）、中藥高劑量組（10只）、鹽酸貝那普利組（10只）。

2.2 給藥方法 8周后，空白組和模型組都給予蒸餾水0.2 mL灌胃；中藥低劑量組、中藥高劑量組分別給予三焦祛濕方3.71 g/kg、7.42 g/kg，灌胃治療；鹽酸貝那普利組將鹽酸貝那普利片溶于羧甲基纖維素鈉中，按照1.3 mg/kg灌胃給藥。共給藥4周。于實驗第12周末取材。留取尿液，血液，腎標本做進一步分析。

2.3 檢測

2.3.1 尿、血標本的檢測 給藥后留取小鼠的24 h尿液，測24 h-UTP。在給藥后第4周末，用異氟烷吸入麻醉小鼠，腹主動脈取血，進行TC、Alb、BUN、Scr等指標的檢測。

2.3.2 腎臟行病理形態觀察 腎組織經固定，脫水，包埋，切片后分別行蘇木素-伊紅（HE）染色、馬松（Masson）染色、過碘酸-六胺銀（PASM）染色，在光鏡下觀察腎組織的結構形態。

2.3.3 免疫熒光法檢測小鼠腎臟IgG的沉積 從4℃冰箱取出腎組織，OCT包埋，迅速放入-20℃冷凍切片機中切片（4 μm），丙酮固定5 min，再用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗3遍，避光封閉免疫球蛋白G（IgG）抗體，室溫下孵育 1 h，PBS再次浸洗，于熒光顯微鏡下觀察熒光強度并做好記錄。

2.3.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測目的蛋白的表達 取出腎組織，剪取100mg，放入離心管中，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，裂解組織，于冰上操作。裂解后，4℃，離心10min（12000r/min），離心半徑10 cm，BCA法檢測組織上清液中蛋白濃度。將蛋白溶液按4∶1的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min使蛋白變性。加樣，經凝膠電泳（根據分子量的大小選擇合適的分離膠濃度）進行蛋白分離，轉膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃孵育一抗過夜，TBST洗膜3次，滴加二抗，室溫搖床孵育1 h，然后進行發光，顯影以及蛋白表達量的分析。

2.3.5 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件對數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 給藥后小鼠尿液24 h-UTP及血清TC、ALB、Scr、BUN的表達 與空白組相比，模型組小鼠尿液UTP增高，血清TC增高，ALB降低，差異有統計學意義（P<0.05）。各治療組與模型組比較，尿液UTP降低，血清TC降低，ALB增高，差異有統計學意義（P<0.05）；各治療組間比較 UTP、TC、ALB，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組小鼠Scr和BUN比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 給藥后各組小鼠血清TC，ALB，Scr，BUN及尿液UTP的表達水平（±s）Tab.1 Expression levels of serum TC，ALB，Scr，BUN and urine UTP of mice in each group after administration（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別動物數TC（mmol/L）ALB（g/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）UTP（μg）空白組 10 2.59±0.18 31.55±2.30 15.80±1.29 6.82±0.91 14.47± 2.18模型組 10 4.27±0.34* 19.90±1.62* 17.13±1.40 7.20±0.59 133.33±24.13*中藥低劑量組 10 3.55±0.06# 23.74±1.14# 16.32±1.30 7.03±0.45 70.45± 9.96#中藥高劑量組 10 3.56±0.05# 24.03±1.04# 16.66±1.11 7.00±0.54 70.17± 6.88#鹽酸貝那普利組 10 3.58±0.16# 25.01±2.00# 17.01±1.33 6.75±0.50 67.36±12.14#

3.2 對腎組織病理形態的影響 光鏡下觀察空白組上皮細胞、基底膜、內皮細胞、系膜細胞及基質、腎小管以及腎間質形態結構均未見明顯異常；模型組可見小鼠腎組織腎小球體積增大，MASSON染色可見基底膜增厚，部分可見到嗜復紅蛋白沉積，PASM染色可見“釘突”形成；與模型組比較，各治療組可見腎小球體積有所減小，偶見嗜復紅蛋白沉積，基底膜增厚減輕，“釘突”減少。見圖1。

圖1 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織病理形態的影響（光鏡，×400）Fig.1 Effect of Sanjiao Qushi Formula on the pathological morphology of renal tissue in mice with membranous nephropathy(light microscope，×400)

3.3 免疫熒光觀察結果 空白組幾乎未見免疫復合物的沉積；其他各組均有不同程度的IgG沿腎小球毛細血管基底膜的沉積。模型組熒光染色較強，各治療組與其相比IgG的沉積明顯減少，熒光強度明顯減弱。中藥高劑量組與鹽酸貝那普利組的IgG沉積無明顯差異，在熒光強度上均弱于中藥低劑量組。見圖2。

圖2 三焦祛濕方對膜性腎病小鼠腎組織IgG沉積的影響（熒光顯微鏡，×400）Fig.2 Effect of Sanjiao Qushi Formula on IgG deposition in mouse kidney with membranous nephropathy mice(fluorescence microscope，×400)

3.4 對腎組織ZO-1、synaptopodin蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組ZO-1、synaptopodin的表達顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組ZO-1、synaptopodin的表達明顯增加（P＜0.05），各治療組間比較ZO-1、synaptopodin差異沒有統計學意義（P＞0.05）。見表 2，圖 3。

圖3 各組小鼠ZO-1、synaptopodin蛋白的表達Fig.3 Expression of ZO-1 and synaptopodin protein of mice in each group

表2 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織ZO-1、synaptopodin蛋白表達的影響（±s）Tab.2 Effects of Sanjiao Qushi Formula on ZO-1 and synaptopodin protein expression in renal tissues of membranous nephropathy mice（±s）

表2 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織ZO-1、synaptopodin蛋白表達的影響（±s）Tab.2 Effects of Sanjiao Qushi Formula on ZO-1 and synaptopodin protein expression in renal tissues of membranous nephropathy mice（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別 ZO-1/ACTIN synaptopodin/ACTIN空白組 0.98±0.08 1.00±0.06模型組 0.25±0.09* 0.37±0.17*中藥低劑量組 0.53±0.09# 0.63±0.13#中藥高劑量組 0.64±0.13# 0.85±0.21#鹽酸貝那普利組 0.52±0.11# 0.72±0.08#

4 討論

MN是腎臟病中較為常見的疾病類型，由于目前沒有特效藥物，且容易帶來一系列并發癥，因此在臨床治療中頗為棘手，蛋白尿的大量丟失是疾病加重的重要原因。而大量漏蛋白主要是腎臟足細胞受損，足突融合消失，濾過膜的完整性被破壞，蛋白漏出形成蛋白尿[11]。其預后與臨床表現具有很大差異，關于疾病的進展有著經典的“三分之一理論”[12]，雖有一定的自發緩解率，但仍需警惕MN可能帶來的血栓栓塞等嚴重并發癥。MN的患者應自確診之日起接受支持治療，盡量減少蛋白質的排泄，以改善預后，提高生活質量。

目前西醫的治療方案主要是激素加免疫抑制劑，同時輔以降壓護腎、調節糖脂代謝、抗凝等治療，取得了一定的臨床療效，但因藥物帶來的滿月臉、水牛背、感染、骨質疏松等不良反應以及停藥后易反彈等局限性，長期應用效果欠佳，因此給臨床治療帶來很大的挑戰。中醫認為MN屬于“水腫”“尿濁”等范疇。課題組在長期的臨床觀察中發現，MN患者日久均有脾腎虧虛之象。中醫理論認為臟腑虧虛日久無力鼓動氣血運行，則三焦氣化不利、血液凝滯；瘀血即為病理產物又是致病因素，故血瘀為MN患者的重要病因之一。導師陳志強教授有著多年的臨床經驗，在治療MN方面有著獨到的見解。陳教授認為MN“脾腎氣陽兩虛，水濕痰瘀內阻，三焦氣化不利”為病機關鍵[13]。脾腎為MN的主要病位，脾腎虧虛導致氣血運行不利，氣虛易發展成陽虛，陽虛不能溫化水濕，水液停聚機體，形成水腫；血不利則為水，亦成水腫；脾腎虧虛失去升清固攝之職，則蛋白易漏出形成蛋白尿。三焦作為臟腑功能正常運行的主要通道，在水液輸布中起著重要作用。一旦受損，則上焦不能宣散，中焦不能燥化，下焦不能泄利，三焦氣化功能失司，水濕邪濁留滯機體，則易發生病變。

據此，陳教授自擬三焦祛濕方治療MN，方中黃芪、炒白術、淫羊藿益氣溫陽，化氣行水；藿香化濕通上焦，陳皮、白豆蔻燥濕運中焦，積雪草、茯苓滲濕利下焦；丹參、川芎、紅花、水蛭活血化瘀通絡。其中黃芪是必用藥，研究顯示[14]，黃芪的有效成分黃芪甲苷Ⅳ可減少細胞骨架的丟失調節相關通路蛋白，恢復足細胞形態，減輕足細胞損傷。中醫認為久病入絡，絡脈纖細深邃，血流緩慢，易發生瘀滯。紅花、川芎等植物類的活血化瘀藥力難以觸及深部，而水蛭等動物類的化瘀通絡藥能破血逐瘀，消除癥瘕積聚，直搗疾病深處。現代藥理研究認為水蛭是作用較強的凝血酶抑制劑，而且對炎性介質具有拮抗作用，能夠減弱免疫復合物的沉積，減輕蛋白尿，保護腎功能[15]。近年來中醫藥在治療疾病方面的優勢逐漸凸顯，但確切的分子機制尚不明確，本研究主要是探討中藥三焦祛濕方對MN小鼠足細胞蛋白表達的影響，以進一步探討MN尿蛋白減少的可能生物學機制，為臨床提供參考。

足細胞是終末分化的細胞，為腎小球提供結構支持，由胞體、初級突起、足突3部分構成，對維持完整的腎小球濾過屏障至關重要，可因遺傳、藥物、感染等誘因被破壞，且破壞之后功能難以恢復[16]。目前認為MN的足細胞破壞，主要是由于腎小球上皮下免疫復合物的沉積，補體系統被激活，形成膜攻擊復合物C5b-9，C5b-9導致足突的融合、凋亡等改變，是蛋白尿加重的重要原因[17-18]。裂孔隔膜蛋白和骨架蛋白的異常表達是足細胞受損的重要表現。毗鄰足突之間有規律的相互交錯，在它們之間形成的間隙為裂孔，之間有裂孔膜橋連接形成裂孔隔膜。ZO-1是分子量為220 kd的蛋白質，在腎小球主要表達于足細胞足突胞質側裂孔隔膜附近，屬于鳥苷酸激酶家族的一種鏈接蛋白，主要附著在裂孔隔膜上，ZO-1與neph-1相互作用形成一個結構穩定的蛋白復合體，形成裂孔隔膜的重要組成部分之一。ZO-1將裂孔隔膜與足細胞骨架蛋白actin相連接，以維持足細胞濾過膜的完整性。Mark C Wagner等[19]研究顯示腎小球損傷后，足細胞消失，ZO-1與neph-1出現解離，兩者之間的相互作用喪失，裂孔隔膜的結構被破壞。表明ZO-1在足細胞裂空隔膜復合體中發揮重要作用。足細胞中ZO-1特異性表達的缺失，會損害裂孔隔膜的形成，導致蛋白尿和腎小球硬化[20]。文獻資料[6]顯示，在C-BSA誘導的MN大鼠模型中ZO-1的表達下降，經藥物治療后其表達量有所增加，表明ZO-1蛋白表達的減少可能是尿蛋白加重的影響因素。

骨架蛋白以肌動蛋白為主，維持著足細胞的特殊結構。synaptopodin是分子量為100 kd的蛋白質，是骨架蛋白的重要組成部分，一種富含脯氨酸的肌動蛋白結合蛋白[21]，與α-actinin-4相互作用，和緊密連接蛋白一起與肌動蛋白微絲密切相連，維持足細胞的結構和功能。synaptopodin調控下游蛋白RhoA的表達，RhoA是影響細胞信號轉導的重要蛋白之一，對維持腎小球的濾過屏障具有重要作用[22]。synaptopodin表達量的降低，會引起足突融合，肌動蛋白細胞骨架的重組。研究顯示[23]，C-BSA誘導的膜性腎病大鼠腎組織synaptopodin的表達明顯下降，治療組與模型組相比其表達量明顯增加，表明synaptopodin表達的減少會加重蛋白尿。據報道[24]，synaptopodin是環孢素的作用靶點，環孢素能夠抑制鈣調磷酸酶的活性，增加突觸足蛋白的豐度，從而起到降低蛋白尿的作用。本研究顯示MN小鼠腎組織中ZO-1、synaptopodin的表達減少；與模型組相比，各治療組ZO-1、synaptopodin的表達均有增加，與文獻中的研究結果是一致的。進一步說明了ZO-1、synaptopodin的表達對維持足細胞正常功能和結構起著重要作用。

本實驗采用尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白誘導小鼠出現MN的病理模型，給予高、低劑量的三焦祛濕方或鹽酸貝那普利片干預，研究表明造模后小鼠出現腎小球毛細血管基底膜增厚、釘突形成、免疫復合物沉積等病理改變，血清白蛋白降低、血脂升高等生化的改變，經三焦祛濕方干預后，MN小鼠的蛋白尿、血脂顯著降低，血清白蛋白明顯升高，療效與西藥組相當。各組小鼠血清尿素氮、肌酐相比變化不大，分析原因可能與實驗時間短，造模后小鼠腎功能尚處于代償階段有關。對目的蛋白ZO-1、synaptopodin的檢測顯示：造模組ZO-1、synaptopodin表達顯著減少，經三焦祛濕方治療后ZO-1、synaptopodin表達顯著增多，由此筆者推測三焦祛濕方減少蛋白尿的機制可能是通過增加ZO-1、synaptopodin的表達，修復足細胞的完整性，從而減少蛋白的漏出，證實了三焦祛濕方治療膜性腎病是有效的。但是由于檢測數據的誤差、實驗中的不可控事件以及客觀實驗條件的限制等因素，使得實驗存在一些不足，其進一步的機制有待未來更深入的研究。