Toll樣受體7基因敲除對水皰性口炎病毒增殖的影響

孟潔潔，宋 月，樊文杰，楊 樂，邢嘉友，王 江，褚貝貝，楊國宇，王夢迪

(1．河南農業大學，農業農村部動物生化與營養重點開放實驗室，鄭州 450046；2.河南牧業經濟學院,食品與生物工程學院，鄭州 450046)

水皰性口炎(vesicular stomatitis，VS)又稱爛舌癥，是由水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)引起牛、馬、豬等哺乳動物的一種高度接觸性傳染病，以水皰性病變為特征，可通過摩擦接觸破損的動物皮膚引起感染，最早出現在美國[1-2]。VS的流行具有季節性、暴發性的特點，較易在夏季發生，通常可在2 h內侵犯牧場內的大批牲畜，給養殖戶帶來巨大的經濟損失。VSV屬于單股負鏈RNA(single stranded negative stranded RNA，ssRNA)病毒，也是一種能夠由昆蟲傳播的橫紋肌病毒，它具有囊膜，并在小鼠中具有神經毒性[3]，是由包括狂犬病毒在內的嗜神經病毒組成的彈狀病毒家族的原型成員。水皰性口炎是由VSV中的糖蛋白G在病毒吸附、內吞和膜融合過程中介導的[1]。糖蛋白G作為VSV的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，可以與Toll樣受體7(Toll-like receptor 7,TLR7)相互作用并激活自噬，從而啟動抗病毒程序[4-6]。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是先天免疫中的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，可以通過與配體相互識別被激活，使信號向下游傳遞，參與適應性免疫應答。TLRs至少有11種，均屬于Ⅰ型跨膜蛋白，TLR7也不例外，它由胞外區、跨膜區和胞內區3個部分組成，其中胞外區可與配體相互識別，跨膜區含有較多的半胱氨酸，胞內區與白細胞介素受體同源，負責信號傳遞。TLR7還能夠特異性識別短鏈RNA及其核苷類似物，在與其配體特異性結合后，通過信號傳導最終可以促進Ⅰ型干擾素的表達，參與到抵抗單鏈RNA病毒感染的天然免疫中[7-11]。本試驗利用CRISPR/Cas9基因定點修飾技術構建PK15細胞TLR7基因穩定敲除細胞系，并研究TLR7基因敲除對VSV-GFP毒株復制規律的影響，以期為防控VSV等RNA病毒引起的疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

豬腎上皮細胞(porcine renal epithelial cells，PK15)、人胚腎上皮細胞衍生細胞系(human embryonic renal epithelial cell derived cell line，HEK293T/17)、非洲綠猴腎上皮細胞(renal epithelial cells of African green monkey，Vero)、VSV-GFP毒株、大腸桿菌Top10感受態細胞均由農業農村部動物生化與營養重點開放實驗室保存；LentiCRISPR V2、pMD2.G以及pSPA×2均購自Addgene公司；T7核酸內切酶及T7 NEBuffer均購自NEB公司；一步法反轉錄試劑盒購自北京密碼子生物科技有限公司；實時熒光定量PCR反應試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；嘌呤霉素、血清、培養基等均購自Thermo公司；CCK-8細胞毒性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 引物設計與合成

根據NCBI數據庫公布的豬源TLR7基因組序列(GenBank登錄號：NM_001097434.1)進行sgRNA預測，最終設計sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3序列用于TLR7基因敲除。此外，在NCBI數據庫中查找豬源VSV-N基因的mRNA序列 (GenBank登錄號：MK934319.1)，并利用Primer Premier 6.0軟件設計引物用于實時熒光定量PCR(表1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 TLR7-sgRNA載體構建

LentiCRISPR v2質粒在BsmBⅠ酶的作用下于37 ℃反應1 h完成單酶切，在電泳并回收后，利用合成的sgRNA引物對分別進行以下反應。引物退火雜交的程序為：95 ℃變性10 min;95 ℃梯度退火至85 ℃(每秒鐘降低2 ℃)，85 ℃梯度退火至25 ℃(每秒鐘降低0.1 ℃);4 ℃保存1 h。在T4 DNA連接酶的作用下，酶切所得大片段與上述產物在4 ℃過夜反應。轉化搖菌涂布平板，然后置于37 ℃溫箱中過夜生長，挑取形狀色澤等良好的單菌落送測序。選取測序無誤的菌液進行質粒提取，稀釋成1 000 ng/μL。

表1 引物信息

續表

1.4 TLR7基因敲除細胞系的構建

1.4.1 慢病毒包裝 將HEK293T/17細胞接種于T-25細胞培養瓶，待細胞融合度達到40%左右時進行轉染。將包裝質粒(pMD2.G)、包膜蛋白質粒(pSPAX2)與構建的重組轉移質粒共轉入HEK293T/17細胞，于37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養48、72 h后收取上清液，將其混合后得到慢病毒液,于-80 ℃保存備用。

1.4.2 多克隆細胞株篩選 將PK15細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到40%左右時進行慢病毒感染。取1 mL慢病毒液混合1 mL DMEM處理PK15細胞。當慢病毒感染細胞48 h后，用含有10% FBS的DMEM培養基(含有8 μg/mL嘌呤霉素)繼續培養細胞，當未感染細胞被殺死后，即可留下所需的陽性細胞。以未作處理的PK15細胞為對照,當對照組細胞全部死亡時，將嘌呤霉素濃度更換為3 μg/mL再進行培養，最后將篩選出來的多克隆細胞進行細胞傳代培養。

1.4.3 Western blotting檢測sgRNA編輯效率 分別接種PK15及篩選出來的3株多克隆細胞于60 mm培養皿中，每皿細胞數為7×105個。待細胞匯合度達到60%時收取目的蛋白，將得到的蛋白進行BCA濃度檢測后，取相應量蛋白進行電泳并轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂乳室溫封閉1 h后，加入TLR7單克隆抗體(1∶1 000稀釋)過夜(4 ℃)，利用1×TBST洗膜3次后，用山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)孵育1 h，利用1×TBST洗膜3次后進行顯影，所選用內參蛋白為β-actin。

1.4.4 單克隆細胞系的篩選 選取編輯效率高的多克隆細胞，通過有限稀釋法進行單克隆細胞系的篩選。再分別將PK15細胞與所得的PK15-TLR7-/-單克隆細胞系接種于60 mm培養皿中，按照1.4.3方法收取蛋白并進行Western blotting檢測。根據檢測結果，進一步提取PK15-TLR7-/-單克隆細胞系基因組并進行PCR擴增，將產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.5 細胞形態觀察

將PK15、PK15-TLR7-/-細胞接種于100 mm培養皿中，于0、6、12、24、36、48 h在光學顯微鏡下仔細觀察細胞形態、大小以及密集程度并拍照。

1.6 CCK-8檢測

將PK15、PK15-TLR7-/-細胞接種于96孔板中，分別于0、6、12、24、36、48 h進行CCK-8檢測，每個時間點做3個重復，加入CCK-8處理后在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h，分別檢測2種細胞在450 nm處的吸光度值。

1.7 流式細胞儀檢測

將PK15、PK15-TLR7-/-細胞接種于24孔板中，當細胞匯合度達到50%時進行細胞計數，采用VSV-GFP感染細胞，病毒感染復數(multiplicity of infection，MOI)為0.01。將計算好的病毒量加入DMEM，混合的病毒懸液渦旋8 s后處理細胞，于37 ℃吸附 1 h后棄去原培養基，PBS清洗后再加入新鮮含有2% FBS的DMEM培養基，分別于0、6、12、24、36 h觀察細胞形態及熒光情況并記錄，同時按照時間點收樣并進行流式細胞儀檢測。

1.8 實時熒光定量PCR檢測

將PK15、PK15-TLR7-/-細胞接種于35 mm培養皿中，待細胞融合度達到50%時進行細胞計數，利用VSV-GFP感染細胞，MOI為0.01。按照1.7方法進行處理后，分別于0、2、4、6、12、24、36 h進行收樣，先加入Trizol進行總RNA提取。獲得總RNA后進行反轉錄合成cDNA，利用設計的實時熒光定量PCR引物進行擴增。PCR反應體系10 μL：SYBR Premix ExTaqⅡ 5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 2.7 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環；繪制熔解曲線，25 ℃反應1 min。

1.9 Western blotting 檢測VSV-GFP的GFP蛋白的表達

分別將PK15、PK15-TLR7-/-細胞接種于60 mm培養皿中。待細胞匯合度達到60%時進行細胞計數，利用VSV-GFP感染細胞，MOI為0.01。按照1.7方法進行處理后，分別于0、4、6、12、24、36 h收樣并提取目的蛋白。一抗為GFP單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，二抗為山羊抗鼠IgG(1∶5 000)，洗膜液為1×TBST，內參蛋白為β-actin，方法同1.4.3。

1.10 VSV-GFP子代病毒滴度測定

分別將PK15、PK15-TLR7-/-細胞接種于6孔板中，待細胞匯合度達到50%時進行細胞計數后，以VSV-GFP感染細胞，MOI為0.01。按照1.7方法進行處理后，分別于0、4、6、12、24、36 h進行收樣，將樣品反復凍融且每次凍存時間不少于8 h，凍融3次后在超凈工作臺內吸取上清吹打底部的細胞碎片，離心后留取上清液。在96孔板中接種Vero細胞，設置12個病毒濃度梯度，以10倍為一個濃度差進行倍比稀釋后處理細胞，于37 ℃、5% CO2培養箱中吸附1 h，棄去培養基，用1×PBS清洗2次，換成含有2% FBS的DMEM培養基進行培養。每隔1 d觀察1次，5～6 d后，觀察細胞病變情況，記錄病變孔并計算半數組織培養感染劑量(TCID50)，最終得到VSV-GFP子代病毒滴度變化。

1.11 數據統計分析

每種試驗均重復3次，利用Excel軟件整理數據并進行雙尾T檢驗分析，數據以平均值±標準差表示，利用GraphPad Prism 8.3軟件進行統計學分析并作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 載體鑒定結果

用BsmBⅠ對LentiCRISPR v2載體單酶切后進行電泳檢測，以LentiCRISPR v2質粒作為對照，結果顯示該載體單酶切后有13 000和1 873 bp 2個目的條帶(圖1A)，與預期一致。 測序結果表明成功構建了重組質粒pTLR7-sgRNA1、pTLR7-sgRNA2和pTLR7-sgRNA3(圖1B)。

A，LentiCRISPR v2酶切電泳圖:M，DL15000 DNA Marker；1，LentiCRISPR v2質粒；2，LentiCRISPR v2單酶切產物。B，序列測定結果A，Enzyme-digestion electrophoresis of LentiCRISPR v2:M，DL15000 DNA Marker;1，Plasmid LentiCRISPR v2;2，Results of LentiCRISPR v2 enzyme digestion.B，Sequence determination results圖1 Cas9/sgRNA載體的構建Fig.1 Construction of the Cas9/sgRNA vector

2.2 PK15-TLR7-/-單克隆細胞系的構建

Western blotting檢測3個sgRNA構建的PK15-TLR7-/-多克隆細胞，結果表明設計的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3均可對TLR7基因進行有效編輯，其中編輯效率最高的為sgRNA2(圖2A)。將編輯效率最高的sgRNA2構建的PK15-TLR7-/-多克隆細胞所篩選得到的單克隆細胞系進行Western blotting檢測，結果顯示，無TLR7蛋白表達(圖2B)。測序結果表明，與正常TLR7基因相比，2號靶位點處插入堿基A導致后續堿基發生移碼突變，證明PK15-TLR7-/-敲除細胞構建成功(圖2C)。

A，Western blotting檢測sgRNA編輯效率:1、2，分別為PK15細胞、sgcontrol細胞；3～5，分別為用sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3構建的PK15-TLR7-/-多克隆細胞。B，Western blotting檢測PK15細胞和PK15-TLR7-/-單克隆細胞中TLR7蛋白的表達情況。C，PK15-TLR7-/-單克隆細胞測序結果A,Western Blotting results of sgRNA editing efficiency detection:1 and 2，PK15 cells and sgcontrol cells,respectively;3-5，PK15-TLR7-/- polyclonal cells constructed with sgRNA1,sgRNA2 and sgRNA3,respectively.B，Western blotting results of TLR7 protein expression in PK15 cells and PK15-TLR7-/- monoclonal cells detection.C，Results of PK15-TLR7-/- monoclonal cell sequencing圖2 單克隆細胞系的構建Fig.2 Construction of monoclonal cell lines

2.3 TLR7基因敲除對PK15細胞增殖和形態的影響

通過光學顯微鏡在不同時間點觀察PK15與PK15-TLR7-/-的細胞形態發現，敲除TLR7基因并不影響PK15的細胞形態(圖3A)。利用CCK-8檢測敲除TLR7基因對PK15細胞增殖的影響發現，PK15-TLR7-/-細胞的活力與PK15細胞無顯著差異(P>0.05)(圖3B)。

2.4 PK15細胞中TLR7基因敲除對VSV-GFP復制的影響

在VSV-GFP感染PK15細胞與PK15-TLR7-/-細胞后的不同時間點，通過熒光顯微鏡進行熒光檢測發現，隨著時間增加，熒光強度逐次增加，且PK15-TLR7-/-細胞的GFP熒光強度強于PK15細胞(圖4A)；與此同時，流式細胞術檢測結果顯示，相同時間點的PK15-TLR7-/-細胞感染VSV-GFP的比例顯著或極顯著高于PK15細胞(P<0.05；P<0.01)(圖4B和4C)，表明敲除TLR7基因促進了VSV-GFP在PK15細胞中的復制。

2.5 PK15細胞中TLR7基因敲除對VSV-N基因mRNA水平的影響

當VSV-GFP感染PK15與PK15-TLR7-/-細胞后，利用實時熒光定量PCR檢測不同時間點VSV-N基因mRNA相對表達量發現，隨著時間增加，VSV-N基因mRNA相對表達量逐漸增加。感染4～36 h時，PK15細胞中VSV-N基因的mRNA相對表達量顯著或極顯著低于PK15-TLR7-/-細胞(P<0.05；P<0.01)(圖5)，表明敲除PK15細胞中TLR7基因能顯著促進VSV-N基因表達。

2.6 PK15細胞中TLR7基因敲除對VSV-GFP GFP蛋白表達的影響

當VSV-GFP感染PK15與PK15-TLR7-/-細胞后，Western blotting檢測不同時間點VSV-GFP GFP蛋白的表達量變化發現，PK15與PK15-TLR7-/-細胞中的VSV-GFP GFP蛋白均從6 h開始表達，并且隨著時間的增加，VSV-GFP GFP蛋白的表達量均逐漸增多，但相較于PK15細胞來說，在PK15-TLR7-/-細胞中VSV-GFP GFP蛋白含量更高(圖6)，因此，在PK15細胞中敲除TLR7基因能夠促進VSV病毒的復制。

*，差異顯著(P<0.05)，**，差異極顯著(P<0.01)，ns，差異不顯著(P>0.05)。下同*,Significant difference (P <0.05),**,Extremely significant difference (P<0.01),ns,No significant difference (P>0.05).The same as below圖3 PK15與PK15-TLR7-/-細胞的形態(A)與活力(B)Fig.3 Morphology (A) and activity (B) of PK15 and PK15-TLR7-/- cells

A，熒光顯微鏡觀察結果(40×)；B，流式細胞儀檢測結果；C，不同時間VSV-GFP的感染率A，Results of fluorescence microscopy (40×);B，The results of flow cytometry;C，Results of infection rate of VSV-GFP at different time圖4 TLR7基因敲除對VSV-GFP復制的影響Fig.4 Effect of TLR7 gene knockout on replication of VSV-GFP

圖5 TLR7基因敲除對VSV-N基因mRNA表達水平的影響Fig.5 Effect of TLR7 gene knockout on VSV-N gene mRNA expression

圖6 TLR7基因敲除對VSV-GFP GFP蛋白表達的影響Fig.6 Effect of TLR7 gene knockout on VSV-GFP GFP protein expression

2.7 PK15細胞中TLR7基因敲除對VSV-GFP子代病毒滴度的影響

當VSV-GFP感染PK15與PK15-TLR7-/-細胞后，檢測不同時間點VSV-GFP子代病毒滴度，結果表明，感染VSV-GFP 6 h后子代病毒開始釋放，此時PK15細胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7-/-細胞，但差異不顯著(P>0.05)；隨著VSV-GFP感染時間的增加，PK15細胞中VSV-GFP子代病毒滴度顯著或極顯著低于PK15-TLR7-/-細胞(P<0.05；P<0.01)(圖7)。說明TLR7基因敲除能夠促進VSV-GFP子代病毒的產生。

圖7 TLR7基因敲除對VSV-GFP子代病毒滴度的影響Fig.7 Effect of TLR7 gene knockout on titer of VSV-GFP progeny virus

3 討 論

本試驗選擇豬PK15細胞作為研究對象，并利用CRISPR/Cas9技術獲得PK15-TLR7-/-穩定的單克隆細胞系。 CRISPR/Cas9基因編輯技術是一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA精準修飾的技術[12]，作為ZFN和TALEN后的第3代基因編輯技術，它具有經濟快捷、操作簡便、效率高等特點，被廣泛應用于基因功能的挖掘、動植物品系的培育以及動物模型的建立等研究領域[13-15]。Xu等[16]利用該技術制備了無外源標記的CD163和pAPN雙等位基因編輯豬，在不影響豬正常生長發育和繁殖性能的前提下，顯著降低了對豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的易感性。Yang等[17]使用CRISPR/Cas9基因編輯技術與體細胞核移植(SCNT)相結合，獲得了血紅蛋白清道夫受體CD163基因敲除的杜洛克豬，并證明了敲除CD163基因的杜洛克豬可完全抵抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。Hübner等[18]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統靶向切割ASFV-p30基因組，導致由ASFV引起的空斑完全消失，最終使病毒產量降低了4個數量級。因此，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術可以用于研究病毒與宿主細胞的聯系、病毒的致病機理等。

TLR7基因于2000年發現[19]，它廣泛表達于多種細胞的內體-溶酶體中，能夠識別某些小分子的抗病毒化合物和病毒mRNA介導的抗病毒的天然免疫反應[19-21]。 當TLR7被活化后，能夠招募髓系分化因子88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)，進而使MyD88活化并招募白細胞介素-1受體相關激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK)，形成4層左手螺旋狀信號復合物，使信號向下游傳遞，最終導致干擾素調節因子(interferon regulatory factor 7，IRF7)磷酸化后入核，產生Ⅰ型干擾素以發揮抗病毒作用[22]。如Martin等[23]通過利用呼吸道合胞病毒感染BALB/c小鼠發現，TLR7的表達量上升，同時釋放了細胞因子IRF5；Diebold等[24]用聚乙烯亞胺與濃縮流感病毒ssRNA的復合物(PEI-RNA)活化野生型小鼠骨髓細胞產生IFN-α，但不能活化TLR7-/-小鼠的骨髓細胞。此外，VSV的宿主非常廣泛，能夠感染植物、無脊椎動物和有脊椎動物，實際生產中也會引起豬急性、熱性、高度接觸性的傳染病[25]。而Lund等[26]用VSV或流感病毒體外感染鼠骨髓細胞，可分泌高水平的IFN-α和白細胞介素-12(interleukin-12，IL-12)，而TLR7-/-小鼠來源的骨髓細胞喪失了對VSV的反應，也表明TLR7能夠活化免疫細胞，并促進炎性細胞因子的釋放，從而發揮抗病毒機制。因此，宿主細胞能夠通過TLR7識別病毒的RNA，從而啟動TLR7依賴的抗病毒機制。本研究發現，TLR7基因敲除可以促進VSV在PK15細胞中的復制，但不影響PK15細胞的形態及活力，進一步驗證了TLR7在宿主細胞抗病毒中扮演著重要的角色。但VSV如何與TLR7相互作用以及TLR7影響病毒復制生活周期中的哪一階段，仍需進一步研究證明。本研究初步驗證了TLR7在天然免疫中的作用，為VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新的思路和策略。

4 結 論

本研究成功構建了豬pTLR7-sgRNA重組質粒并最終得到了PK15-TLR7-/-單克隆細胞系，通過檢測敲除TLR7基因對VSV-GFP復制情況的影響，證明敲除TLR7基因在一定程度上促進了VSV復制。