牛繁殖性狀候選基因研究進展

邵燕弟，蔣秋斐，封 元，王 瑜，張 娟，周子航，王衛振，禹保軍，馮小芳，陳亞飛，顧亞玲

(1.寧夏大學農學院，銀川 750021；2.寧夏畜牧工作站，銀川 750021)

繁殖性狀是牛經濟性狀的重要組成部分，提高牛群繁殖率是增加養殖業經濟效益的關鍵環節。牛屬于單胎動物，通常一胎產一犢，繁殖率低下。 牛的群體雙胎遺傳力和排卵遺傳力分別為0.03和0.07，自然狀態下的雙胎率僅為0.15%～2.99%[1]。因此，提高牛的繁殖率成為現代畜牧工作者的關鍵任務，是國內外研究的熱點。 Ealy等[2]根據過去25年完成的工作，發現接受體外胚胎生產的牛中只有27%能產下活牛。生殖性狀表現出低到中等的遺傳力，需要分子標記來加快這些具有經濟價值的性狀的遺傳進化。近年來，采用胚胎移植等技術提高繁殖率，具有遺傳選擇研究進展慢、繁瑣、成本高等問題。隨著分子生物技術的發展，人們開始從基因水平上進行探索，為提高牛繁殖性狀的研究提供了新思路。國內外運用各種分子方法研究與牛繁殖相關的基因，通過篩選關鍵候選基因、功能驗證等來確定牛繁殖性狀相關基因，以期提高牛繁殖率促進農牧業發展。作者主要對精液品質、卵泡發生、排卵、早期胚胎發育、產犢難易及產犢間隔相關候選基因進行了歸納總結，旨在為牛繁殖性狀的遺傳改良提供理論參考依據。

1 精液品質相關候選基因

動物的精液品質受多基因控制，遺傳力較低。季節、年齡、遺傳等都能影響精液品質。種公牛的精液品質是影響母牛受胎的主要因素之一。Bhakat等[3]通過研究年齡對種公牛精液品質的影響發現，隨著年齡的增加精子活力降低，畸形率也有所增加。該部分將對促黃體素受體(luteinizing hormone receptor,LHR)基因和牛精子鞭毛2 (sperm flagella 2,SPEF2)基因在精液品質方面的研究進行歸納總結。

1.1 LHR基因

LHR屬于糖蛋白激素受體亞家族[4]。馬富龍等[5]通過研究LHR基因在牦牛不同發育階段睪丸中的表達，發現睪丸組織中LHR可能在精子成熟過程中發揮作用。LHR基因內含子9發生A51703G及G51656T的突變，分別引起BfaⅠ酶切位點及HinfⅠ酶切位點多態性，通過關聯分析發現，種公牛精液品質與LHR基因的多態性有關[6]。孫麗萍等[7]等通過研究144頭中國荷斯坦牛和79頭河南地方肉牛品種的多態性與精液品質之間的關系，發現LHR基因G51656T位點檢測到TT和GT 2種基因型，且TT基因型精子密度顯著高于GT基因型,對河南地方肉牛品種的精子密度影響顯著，可作為影響牛精液品質的候選基因。此外，Sun等[8]對中國荷斯坦牛的研究發現，LHR基因A51703G位點AG基因型新鮮精子活力高于AA基因型和GG基因型。上述研究說明LHR基因在精子密度、精子活力等方面發揮著重要作用。

1.2 SPEF2基因

SPEF2基因，又稱KPL2基因，位于20號染色體上。SPEF2基因在精子尾部的形成和發育中起重要作用。研究表明，SPEF2基因突變導致精子發生受損，出現尾部缺陷，并導致精子活力降低[9]。通過對中國荷斯坦公牛群體進行基因型檢測分析，在SPEF2基因第1內含子篩選到1個單突變位點(g.11043C>T)，發現該位點與精子畸形率顯著相關[10]。此外，Guo等[11]研究發現，SPEF2基因外顯子20中的1個SNP(c.2851GOT)位于1個假定的外顯子剪接增強子內，可能產生SPEF2-SV3(剪接變異體)，并與精液畸形率和解凍后冷凍保存精子的活力有關。 Sweett等[12]使用加權單步基因組BLUP法對265頭雜交肉牛進行全基因組關聯分析，以識別與精子活力相關的分子標記，結果發現，SPEF2基因與精子濃度、發育和運動有關。SPEF2基因在人及小鼠上的研究相對較多，后續可深入挖掘該基因在牛方面的研究。

2 卵泡發生、排卵相關候選基因

卵母細胞分泌誘導卵泡形成、促進顆粒細胞增殖、調節類固醇生成和維持發育中卵泡結構的信號[13]。 促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)通過垂體門靜脈系統作用于垂體前葉，刺激垂體合成并釋放促黃體激素(luteinizing hormone,LH)和促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)，在卵泡發生及排卵中發揮重要作用[14]。轉化生長因子-β(TGF-β)超家族中的成員調控著早期卵泡的發生，其中，抗苗勒氏管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)存在于卵母細胞周圍的顆粒細胞中，與原始卵泡重新聚集到卵泡發生的生長階段有關[15]。TGF-β家族的骨形態發生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)和生長分化因子9 (growth differentiation factor 9,GDF9)通過復雜的旁分泌信號過程直接誘導卵泡發育[16]，首先在初級卵泡內的卵母細胞中發現，且在排卵后仍存在于卵母細胞中[17-18]。

2.1 FSH和LH基因

FSH和LH均由垂體前葉釋放，是對卵泡發生和排卵起重要作用的糖蛋白類激素[19]。α亞基為促性腺激素所共有，β亞基決定促性腺激素的生物學特異性[20-21]。Chu等[22]研究證明，LH信號可以控制卵巢中卵母細胞的成熟和排卵。Da等[23]研究表明，FSH刺激增加了非哺乳期荷斯坦牛活體采卵的中型卵泡數量和比例。此外，Zhang等[24]通過研究FSH對玻璃化冷凍卵巢移植物血供和卵泡存活的影響發現，在玻璃化冷凍保存卵巢時補充0.3 IU/mL FSH可增加小鼠卵巢移植物的血供和卵泡存活率。Xiao等[25]研究發現，當在牛體外受精培養液中添加5 mg/mL FSH和50 IU/mL LH時，牛體外受精胚胎卵裂率和囊胚率均顯著高于對照組。朱芳賢等[26]研究不同劑量(22 AU和20 AU)FSH對文山牛超數排卵效果的影響發現，22 AU組的有效胚胎率高于20 AU組，表明FSH劑量是影響超數排卵效果的關鍵因素。以上研究表明，FSH和LH基因在動物卵泡發生及排卵過程中起著重要作用。

2.2 GnRH基因

GnRH是下丘腦分泌產生的激素，對動物生殖調控起重要作用。有研究表明，受單側顆粒膜細胞瘤(GTCT)影響的母馬具有攻擊性行為，通過GnRH免疫對4只母馬的卵巢大小、睪酮濃度及攻擊性行為進行研究，結果表明，GnRH疫苗通過產生結合內源性GnRH的循環抗體來抑制卵巢活性[27]。結合的內源性GnRH不能與垂體前葉的受體結合，導致FSH和LH分泌減少。Liu等[28]為研究GnRH對2種低劑量(375和250 μg)前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2)誘導泌乳奶牛黃體溶解后排卵反應的影響，發現在2種低劑量PGF2α誘導的黃體完全溶解后，GnRH給藥增加了排卵率。此外，Liu等[29]評估了人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)和GnRH對泌乳奶牛不同發情期排卵反應的影響，結果發現，在不同發情期hCG誘導的排卵均比GnRH誘導的晚，但是2種治療在排卵率方面沒有差異。 Bittar等[30]在產后17和20 d給荷斯坦奶牛施用2劑GnRH，成功誘導了泌乳24 d的奶牛排卵，且產后早期給予GnRH可誘導排卵而不影響子宮健康。

2.3 AMH基因

AMH是卵巢早期有腔卵泡的顆粒細胞合成分泌的一種糖蛋白激素，TGF-β超家族的一員。AMH水平與多個物種雌性動物的生殖力相關，因而，血液中AMH水平影響母牛繁殖性能的高低[31]。有研究表明，相比于野生小鼠，缺失AMH的小鼠能夠募集更多的原始卵泡，表明AMH抑制了原始卵泡的募集[32]。Weenen等[33]為研究AMH在人類卵泡發生中的作用，通過人卵巢中AMH免疫染色表明AMH在初始和循環募集過程中的作用，結果證實了先前在大鼠和小鼠中的觀察結果，即AMH在卵泡發生過程中發揮著重要作用。李樹靜等[34]為研究供體牛超排過程中陰道栓(CIDR)埋置、人工授精和胚胎回收3個時間外周血AMH濃度與荷斯坦青年奶牛體內胚胎生產效率的相關性，對96頭荷斯坦青年奶牛進行超排處理,結果發現，外周血AMH濃度在一定程度可以反映供體牛超排的效果，可以作為供體牛(體況適中)篩選條件之一。此外，Nawaz等[35]為研究AMH的基因組遺傳力及相關的基因組區域，使用Zoetis中密度面板對2 905頭荷斯坦奶牛進行基因分型，通過全基因組關聯分析評估AMH的基因組遺傳率，結果顯示，牛AMH與卵巢卵泡儲備、生育力、壽命和超數排卵反應之間有著高遺傳率。在輔助生產過程中，AMH可以作為家畜生育能力、超數排卵和卵巢疾病的潛在預測指標[36-37]。

2.4 GDF9和BMP15基因

GDF9和BMP15是TGF-β超家族的成員[38]，二者均是卵母細胞分泌的因子，對卵泡發育和排卵有顯著影響，對控制雌性生殖中的卵巢功能起主導作用[39-40]。Alam等[41]研究了GDF9和BMP15對體外培養的牛卵母細胞-顆粒細胞復合體(OGCs)形成竇樣結構的影響，從早期有腔卵泡中收集含有卵母細胞的OGCs，用于制備去卵細胞復合物(OXCs)和顆粒細胞復合物(GCs)，發現在不含GDF9和BMP15或僅含BMP15的OXCs和GCs中，生長顆粒細胞分化為成纖維細胞樣細胞，而GDF9和BMP15的組合抑制了成纖維細胞樣細胞的出現，結果表明，卵母細胞通過阻止顆粒細胞分化維持復雜的完整性，并通過GDF9和BMP15參與卵泡腔的形成。BMP15和GDF9能夠通過受體與骨形成蛋白2型受體(bone morphogenetic protein receptor type 2,BMPR2)結合,進而調控下游代謝反應，研究發現，btacircRNA11396通過海綿吸附效應抑制miR-187的活性,促進BMPR2表達，抑制細胞凋亡，從而調節牛卵丘細胞的狀態，影響卵泡發育[42]。通過原位雜交表明，BMP15基因在牛的初級卵泡和次級卵泡早期、顆粒細胞以及次級卵泡的晚期都有表達[43]。劉暢[44]研究發現，BMPR2是miR-375的直接靶基因,而BMPR2是BMP15和GDF9唯一且共同的Ⅱ型受體，因此推測miR-375調控BMP15和GDF9的相關通路,表明BMP15及GDF9對miR-375具有調控作用，從而影響牛卵丘細胞的增殖與凋亡。GDF9和BMP15在生殖系統中發揮著重要作用，尤其在卵泡發育方面。近幾年，GDF9和BMP15在基因多態性與羊產羔數的關聯分析的研究較多，如晁哲等[45]通過關聯分析發現，海南黑山羊GDF9基因+2 541處發生的C/T突變與初胎產羔數顯著相關，且TT基因型顯著高于CC基因型。孫慶等[46]通過Sequenom MassARRAY SNP技術發現，魯中肉羊GDF9基因G5位點不同基因型與初胎產羔數顯著相關，結果可為產羔數性狀的選育提供理論參考依據。GDF9和BMP15基因在牛上的研究相對較少，需要進一步研究。

3 早期胚胎發育及產犢難易相關候選基因

胚胎死亡率是牛生產系統中繁殖效率和盈利能力的主要影響因素。胚胎不能生長無疑會導致胚胎丟失，因此被認為是牛繁殖失敗的重要原因[47]。早期胚胎發育對后期胚胎著床和妊娠至關重要[48]。良好的胚胎發育是順利產犢的關鍵。產犢難易也是影響牛繁殖性能的一個重要指標。胎次、產犢季節、犢牛初生重等對產犢難易有顯著影響。因而，預防難產、降低難產率顯得格外重要。下面將從JY-1、尾型同源框2(caudal type homeobox 2,CDX2)基因對早期胚胎發育的調控作用及冠毛素2(pappalysin 2,PAPP-A2)基因對產犢的調控方面進行歸納。

3.1 JY-1基因

JY-1基因編碼一種具有多個mRNA轉錄本的分泌蛋白，這些轉錄本含有相同的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)，但3′-UTR的長度不同。JY-1 mRNA和蛋白質是卵母細胞特異性的，可在整個卵泡發生過程中檢測到。 母體來源的JY-1 mRNA存在于早期牛胚胎中，且是囊胚發育所必需的。因而，JY-1是一種卵母細胞表達基因，可調節牛早期胚胎的發育[49]。在卵母細胞體外成熟期間，JY-1蛋白的消耗有效地降低了卵丘細胞的擴張、MⅡ期卵母細胞百分比及早期胚胎卵裂的比例[50]。通過siRNA顯微注射使受精卵JY-1基因敲除，降低了JY-1 mRNA和蛋白的表達，并顯著降低了8-細胞、16-細胞和囊胚階段的發育速率[49]。de Camargo等[51]對385頭奈洛爾母牛JY-1基因的外顯子1和外顯子2進行了PCR測序研究，通過連鎖不平衡分析發現Chr29：12 999T/A與早孕的發生有關。此外，de Camargo等[52]對20頭無血緣關系的瘤牛和水牛的JY-1基因外顯子區域進行了序列測定，與瘤牛序列相比，在水牛序列外顯子3的編碼區檢測到胸腺嘧啶的插入，從而導致移碼突變，改變了水牛蛋白的19個末端氨基酸，并提前產生了一個終止密碼子，這一發現解釋了瘤牛和水牛在卵泡發生、胚胎發育和雙胞胎懷孕發生率方面的差異。以上結果表明，JY-1在受精后介導胚胎發育進程中具有重要作用。

3.2 CDX2基因

CDX2是尾部相關同源框轉錄因子基因家族的成員。CDX2在胚胎發育過程起維持胚胎生長、誘導細胞分化和器官形成的作用[53]。CDX2從桑椹胚階段開始就對滋養外胚層起重要作用[54]。劉欣[55]在檢測牛體外受精胚胎時發現，在早期胚胎發育各時期均有CDX2 mRNA表達，囊胚期的內細胞團和滋養層細胞中有CDX2蛋白的表達。使用牛滋養外胚層衍生的CT-1細胞系檢測CDX2在牛滋養層基因調控網絡中的作用，結果表明，CT-1細胞中的多個滋養層基因(FNT、HAND1、ASCL2和SOX15)受CDX2的調節[56]。為研究CDX2在內細胞團和滋養外胚層分化中的功能，利用RNA進行干擾使CDX2下調，將CDX2特異性短干擾RNA(siRNA)注射到牛受精卵中，結果發現，CDX2下調影響桑椹胚到胚泡階段囊胚腔形成和細胞增殖的時間，表明CDX2對牛胚胎內細胞團和滋養外胚層譜系分化的早期發育和基因表達至關重要[57]。

3.3 PAPP-A2基因

PAPP-A2由妊娠相關血漿蛋白A2基因編碼，是一種金屬蛋白酶，特異性地裂解IGF結合蛋白5(IGFBP-5)，增加IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的利用率[58]。PAPP-A2在胚胎生長發育中起重要作用，異常的PAPP-A2水平與先兆子癇、唐氏綜合征、發育性髖關節發育不良等多種疾病存在相關性，但具體機制仍不清楚。 在荷斯坦牛中，在16號染色體上檢測到一個與產犢難易有關的QTL，該QTL位于PAPP-A2基因區域[59]。Wickramasinghe等[60]對荷斯坦公牛的7個標簽單核苷酸多態性進行了標記性狀關聯分析，發現3個SNPs在荷斯坦奶牛中處于強連鎖不平衡狀態，與產犢難易、生產壽命、產奶量和蛋白質產量呈顯著正相關。 以上結果表明，PAPP-A2基因可作為牛繁殖相關的候選基因，在產犢難易方面發揮重要作用。

4 產犢間隔相關候選基因

產犢間隔又稱胎間距，即2次產犢間的時間間隔，可以用來描述奶牛繁殖效率的指標之一。de Vries等[61]研究了佛羅里達和佐治亞州奶牛場1976—2002年間繁殖性能的變化趨勢，發現平均產犢間隔由1976年的399 d增加到2000年的429 d。此外，Refsdal[62]為研究挪威牛繁殖性能的變化趨勢，利用1985—2005年每年的牛計算出繁殖力指數，平均繁殖力指數沒有明顯的變化趨勢，產犢間隔也基本穩定在12.4～12.6個月之間。Ogawa等[63]使用隨機回歸模型和重復性模型估計了日本黑牛產犢間隔的遺傳參數，分析了36 178頭奶牛的92 019個產犢間隔記錄，得出隨機回歸模型估計遺傳力為0.12～0.20，重復性模型估計遺傳力為0.17。因此，產犢間隔的遺傳力較低，今后可針對產犢間隔進行遺傳改進。研究表明，唾液酸結合Ig樣凝集素5(sialic acid binding ig like lectin 5,SIGLEC5)、CXC基序趨化因子受體1(C-X-C motif chemokine receptor 1,CXCR1)、叉頭轉錄因子O1(forkhead box O1,FoxO1)等基因與產犢間隔相關[64-66]，可作為產犢間隔的潛在候選基因，為縮短產犢間隔，提高繁殖力提供參考依據。

4.1 SIGLEC5基因

SIGLEC5基因編碼的蛋白質是Siglecs的CD33相關子集的成員，Siglecs是一個凝集素家族，屬于免疫球蛋白超家族，識別糖蛋白的唾液酸殘基[67]。利用干擾素刺激基因15(interferon stimulating gene 15,ISG15)在外周血中(總白細胞中)的表達水平能對自然發情奶牛做出較為準確的妊娠診斷，為早期妊娠診斷提供理論依據[68]。Puckowska等[64]通過測序和限制酶Msp 1消化鑒定了外顯子3的新錯義多態性(A>G)，使得SIGLEC5蛋白(R260Q)第260位氨基酸精氨酸被谷氨酸取代，結果表明，SIGLEC5 R260Q的多態性與奶牛的空懷天數、產犢間隔以及公牛產犢間隔的育種值有關，因而SIGLEC5基因外顯子3中新的錯義多態性A>G是荷斯坦-弗里斯牛繁殖性狀(產犢間隔和空懷天數)的一個潛在的遺傳標記。SIGLEC5基因在牛繁殖方面的相關研究很少，因此可作為牛繁殖性狀的候選基因進一步研究。

4.2 CXCR1基因

CXCR1是只含1條肽鏈的糖蛋白，屬紫紅質樣G蛋白偶聯受體超家族成員。CXCR1基因定位于2號染色體，具有豐富多態性。王夢琦等[65]通過飛行時間質譜法檢測865頭荷斯坦牛CXCR1基因編碼區，發現CXCR1-816 C>A位點對產犢間隔影響顯著，AC基因型個體產犢間隔顯著低于AA型個體。CXCR1基因CDS區SNP可作為縮短產犢間隔候選分子標記之一。Jecminkova等[69]通過對786頭捷克弗萊維赫奶牛的表型數據與繁殖性狀進行關聯，雖然發現CXCR1 c.777C>G與產犢間隔等繁殖性狀沒有關聯，但為后續的研究提供理論依據，目前CXCR1基因在產犢間隔方面的研究較少，后續可深入對該基因的研究。

4.3 FoxO1基因

FoxO1參與細胞凋亡、氧化應激和細胞分化[70-71]。FoxO1是第一個發現的FoxO轉錄因子家族成員。趙佳強等[66]在中國荷斯坦奶牛中發現FoxO1基因有CC、TT、CT 3個基因型,該基因不同基因型對奶牛產犢間隔、空懷期以及初產日齡這幾個繁殖性狀均有顯著影響，發現CT基因型平均產犢間隔為470.24 d,顯著少于TT基因型產犢間隔661 d，表明CT基因型奶牛要比TT基因有更好的繁殖性能。目前，有關大鼠、小鼠、黑猩猩、人和豬FoxO1基因的研究已有報道，但有關牛FoxO1基因的研究報道較少。以上研究表明，FoxO1基因對牛產犢間隔有影響，后續可深入研究牛FoxO1基因對牛繁殖性狀的調控功能。

5 小 結

作者主要對牛繁殖性狀及其相關基因(精液品質(LHR、SPEF2)、卵泡發生和排卵(FSH、LH、GnRH、AMH、GDF9、BPM15)、胚胎發育及產犢難易(JY-1、CDX2、PAPP-A2)、產犢間隔(SIGLEC5、CXCR1、FoxO1))進行了介紹，目前對這些基因作用機制的研究還不深入，因此對已確認功能的基因仍需進行深入研究，并不斷探索與牛繁殖性狀相關的新候選基因。牛的繁殖性狀在遺傳改良中占據重要地位,但是繁殖性狀的遺傳力較低，常規育種耗時且效果差。近年來，隨著高通量技術不斷發展，成本也逐漸降低，在全基因組范圍內為牛繁殖性狀的分子研究提供了新的思路。全基因組關聯分析與多組學聯合分析已廣泛用于鑒定各物種相關性狀的候選基因和分子標記，得到了較多新的候選基因和顯著相關的SNP。目前，已經通過全基因組關聯分析等方法篩選到一些與繁殖性狀相關的候選基因，但是在各牛種中的結果不盡相同，在相同牛種中也有不同的結果，其原因為繁殖性狀受微效多基因控制。今后需將各種方法聯合使用，確定重疊基因，將重疊基因作為影響繁殖性狀的候選基因，以期進一步提高牛繁殖率。