加味平胃口服液提取工藝研究

陳昱驍，李煥娟，席曉花，郝 潔，周德剛，司紅彬

(1.廣西大學動物科學技術學院，亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004；2.洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽 471003)

雞傳染性腺胃炎是由多種因素混合感染所引起的一種具有傳染性的綜合征。該病在中國最早由王永坤等[1]于1996年在山東、江蘇等地發現，目前在國內已成流行趨勢，給養雞業帶來了嚴重的經濟損失。加味平胃口服液是用于治療家禽傳染性腺胃炎等病癥的復方口服液，其依據傳統中獸醫理論，結合現代中藥藥理研究，在經典方劑平胃散[2-3]的基礎上加減而成，由蒼術、厚樸、陳皮、木香、苦參、枳殼和甘草七味藥組成。其功能為益氣健脾，消食開胃，主治家禽采食及飲水減少、生長遲緩或停滯、飼料轉化率低及飼料消化不充分等癥狀。

揮發油是中藥發揮療效的重要物質基礎之一，但其提取工藝一直是限制含揮發油制劑質量的瓶頸問題。傳統含揮發油的芳香性藥物多以武火迅速煮沸，數分鐘后，改用文火略煮，盡量避免久煎。現代揮發油的提取方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑法、壓榨法和吸收法、微波法、超聲法、超臨界流體萃取法和亞臨界水提取法等，其中水蒸氣蒸餾法以水為溶劑，設備簡單，易操作且成本較低，是目前制藥企業普遍采用的通用方法。劉巧明等[4]通過正交試驗考察清肺口服液的水提方法，結果最佳提取工藝為8倍水浸泡1 h,回流提取2次,每次1.5 h；喬紅培等[5]采用L9(34)正交試驗，分別對揮發油提取工藝和水提工藝進行優化，結果揮發油提取工藝為加6倍量的石油醚，浸泡12 h，超聲震蕩提取1 h；水提工藝為加10倍水煎煮，煎煮3次，每次1 h。本研究采用類似方法先將蒼術、厚樸、陳皮、木香和枳殼五味藥材進行揮發油提取，藥渣混合剩余藥材進行水煎煮提取。

臨床試驗表明加味平胃口服液效果顯著、可靠。本研究采用正交試驗等方法，確定加味平胃口服液科學合理、高效量產的提取工藝，以期為加味平胃口服液量產提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥材

蒼術、厚樸、陳皮和枳殼均購自河南省修之合藥業有限公司；木香購自河南省三禾藥業有限公司；苦參購自甘肅惠森藥業有限公司；甘草購自安徽聚草中藥飲片股份有限公司；以上藥材經鑒定符合《中華人民共和國獸藥典》2020年版有關規定。苦參堿對照品、氧化苦參堿對照品和柚皮苷對照品均購自中國食品藥品鑒定研究院。

1.2 主要試劑及儀器

乙腈購自Fisher公司；甲醇購自天津四友精細化學品有限公司；乙酸銨購自西隴科學股份有限公司；三氯甲烷購自煙臺市雙雙化工有限公司。

U3000型高效液相色譜儀購自Thermo公司；1260型高效液相色譜儀購自安捷倫公司；Water，C18 5 μm，4.6 mm×250 mm型色譜柱購自XBridge?公司；100-5-C18，4.6 mm×250 mm型色譜柱購自Kromassil公司；DEKW-S-4型水浴鍋購自北京永光明公司；KQ5200DA型超聲清洗儀購自昆山市超聲儀器有限公司；XSR205型和AB265-S型電子分析天平均購自梅特勒托利多公司；RV8旋轉蒸發儀購自IKA公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵購自鞏義予華儀器有限責任公司；DFT-100手提式粉碎機購自溫嶺市林大機械有限公司；DZTW調溫電熱套購自北京市永光明醫療器械有限公司。

1.3 揮發油提取工藝研究

1.3.1 飲片粒度處理 稱取2/5個處方量的蒼術、厚樸、陳皮、木香和枳殼，共4份，第1份飲片不處理直接投料，第2份飲片切成1～2 cm后投料，第3份飲片粉碎至全部通過12目篩后投料，第4份飲片粉碎過12目篩后用濾紙包埋之后投料。分別將上述飲片投料于三頸瓶中，加入10倍量水，連接揮發油提取器，待沸騰后開始計時，共蒸餾10 h，每1 h讀取揮發油的量，繪制曲線圖，比較不同飲片粒度揮發油提取量的差異[6-7]。

1.3.2 揮發油提取工藝正交試驗 選定溶劑倍量(A)、浸泡時間(B)和煎煮時間(C)3個因素，每個因素各取3個水平，進行L9(34)正交試驗，選用揮發油提取量作為評價指標，篩選最佳揮發油提取工藝條件[8-9]。主要因素水平見表1。

根據1.3.1試驗結果，按處方比例稱取1/5個處方量的蒼術、厚樸、陳皮、木香和枳殼，置三頸瓶中，連接揮發油提取器，按照表1因素水平進行正交試驗，提取結束后讀取揮發油提取量[10]。

表1 揮發油提取工藝正交試驗因素水平表

1.3.3 揮發油提取工藝驗證試驗 稱取1/5個處方量的蒼術、厚樸、陳皮、木香、枳殼飲片，平行3份，采用正交試驗所優選的揮發油提取工藝進行驗證試驗，讀取揮發油提取量[11]。

1.4 水煎煮提取工藝研究

1.4.1 水煎煮提取工藝正交試驗 選定溶劑倍量(A)、煎煮時間(B)和提取次數(C)3個因素，每個因素各取3個水平，進行L9(34)正交試驗[12]，選用柚皮苷含量和苦參總堿含量(苦參堿+氧化苦參堿總含量)作為評價指標，篩選最佳提取工藝條件[13]。主要因素水平見表2。

根據1.3.1試驗結果，按處方比例稱取1/5個處方量的蒼術、厚樸、陳皮、木香和枳殼，置三頸瓶中，連接揮發油提取器，按照1.3.2確定的揮發油提取工藝提取揮發油，餾液8層紗布濾過，藥渣合并1/5個處方量的苦參和甘草，按照表2因素水平進行正交試驗，提取液8層紗布濾過，合并濾液及餾液，60～70 ℃減壓濃縮至1 g/mL[14]。

表2 水煎煮提取工藝正交試驗因素水平表

1.4.2 加味平胃口服液中柚皮苷含量測定

1.4.2.1 色譜條件 色譜柱：Water，XBridge?C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫為30 ℃，以乙腈-水(20∶80)為流動相，檢測波長為283 nm，流速為1 mL/min。

1.4.2.2 對照品溶液的制備 取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.1 mg/mL的溶液，濾過，取續濾液。

1.4.2.3 供試品溶液及陰性對照溶液配制 取加味平胃口服液，精密移取2 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，上清液濾過，取續濾液。另取缺枳殼的陰性對照同法制成陰性對照溶液。

1.4.2.4 測定 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀進行測定[15-16]。

1.4.3 加味平胃口服液中苦參總堿含量測定

1.4.3.1 色譜條件 色譜柱：Kromassil，100-5-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫為30 ℃，以乙腈-[0.01 mol/L乙酸銨溶液(濃氨試液調pH 8.1)](3∶2)為流動相 A，0.01 mol/L乙酸銨溶液(濃氨試液調pH 8.1)為流動相 B，按照表3程序進行梯度洗脫；檢測波長為225 nm，流速為1 mL/min[17]。

表3 洗脫梯度表

1.4.3.2 對照品溶液的制備 取苦參堿對照品、氧化苦參堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為苦參堿0.04 mg/mL、氧化苦參堿0.008 mg/mL的混合溶液，過濾，取續濾液。

1.4.3.3 供試品溶液及陰性對照溶液配制 取加味平胃口服液，精密移取5 mL，置分液漏斗中，加30 mL水和1 mL氨水，混勻，加三氯甲烷振搖提取2次，每次25 mL，合并三氯甲烷液，減壓濃縮至干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續濾液。另取缺苦參的陰性對照同法制成陰性對照溶液。

1.4.3.4 測定 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各5 μL，注入液相色譜儀進行測定[16]。

1.4.4 水煎煮提取工藝驗證試驗 按處方比例稱取1/5個處方量的飲片，平行3份，先按確定的揮發油提取工藝提取揮發油，餾液8層紗布濾過，藥渣合并苦參、甘草，再采用正交試驗所優選的水煎煮提取工藝進行驗證試驗，提取液8層紗布濾過，合并濾液及餾液，60～70 ℃減壓濃縮并分別定容至1 g/mL，檢測柚皮苷含量、苦參總堿含量[18]。

1.5 數據統計與分析

揮發油提取工藝篩選中以揮發油提取量為指標，通過正交設計助手Ⅱ進行分析，采用極差法進行最佳因素排序，并得出最優組合。

水煎煮提取工藝篩選中以柚皮苷含量和苦參總堿、含量為指標，設定加權系數分別為0.4和0.6，采用綜合加權評分法，計算出各次試驗的綜合評分。具體評分方法：以柚皮苷含量最大的一次試驗判為100分，按照每次試驗柚皮苷含量與最大柚皮苷含量的比例，計算各自柚皮苷含量指標中的得分。 同法，計算每次試驗的苦參總堿含量得分。最后按照兩項指標的加權系數，計算出各次試驗的綜合評分[19]。

綜合評分=(柚皮苷含量/柚皮苷最大含量)×100×0.4+(苦參總堿含量/苦參總堿最大含量)×100×0.6

根據綜合評分結果，通過正交設計助手Ⅱ進行分析，采用極差法進行最佳因素排序，并得出最優組合。

2 結 果

2.1 揮發油提取工藝

2.1.1 飲片粒度對揮發油量的影響 從揮發油量來看，飲片粉碎后的提取效果最好，1～2 cm的飲片次之，飲片不處理和飲片粉碎后包埋的效果最差(圖1)。綜合成本、對環境的影響及實際操作等因素選擇1～2 cm的飲片更為合理。從每小時揮發油量的變化趨勢來看，揮發油在提取9 h后趨勢變緩，可將正交試驗中煎煮時間最長定為10 h。

圖1 揮發油提取量曲線圖Fig.1 Volatile oil extraction volume curve

2.1.2 揮發油提取工藝正交試驗結果 正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5。極差直觀分析結果表明，影響揮發油提取因素大小為C>B>A,即煎煮時間(C)>浸泡時間(B)>溶劑倍量(A)。經方差分析，煎煮時間對提取效果有極顯著影響(P<0.01)；而浸泡時間和溶劑倍量對提取效果影響較小，各水平間差異不顯著。

綜合分析以上結論，影響提取效果的因素順序為：C>B>A，且C3>C2>C1，A1=A3>A2，B1>B2=B1，所以優選出來的工藝為A1B1C3，即8倍水，不浸泡，煎煮10 h。

表4 揮發油提取正交試驗及直觀分析結果

表5 揮發油正交試驗方差分析結果

2.1.3 揮發油提取工藝驗證試驗結果 3份1/5處方量的藥材揮發油提取量結果分別為1.2、1.2和1.3 mL，說明揮發油提取工藝穩定。

2.2 水煎煮提取工藝

2.2.1 水煎煮提取工藝正交試驗結果 正交試驗結果見表6，方差分析結果見表7。根據以上結果可知，在所選因素水平范圍內，提取次數(C)>煎煮時間(B)>溶劑倍量(A)，其中提取次數對柚皮苷含量和苦參總堿含量有顯著影響(P<0.05)，且C3>C2>C1；溶劑倍量和煎煮時間對其無顯著影響(P>0.05)。綜合考慮，優選提取工藝為A2B2C3。確定水煎煮工藝為8倍水，煎煮1.5 h，提取3次。

2.2.2 水煎煮提取工藝驗證試驗結果 由表8可知，柚皮苷含量分別為3.61、3.59和3.63 mg/mL，RSD為0.6%，苦參總堿含量分別為1.23、1.21和1.25 mg/mL，RSD為1.7%，表明該工藝穩定，可行。

表6 水煎煮正交試驗結果及直觀分析結果

表7 水煎煮正交試驗方差分析結果

表8 水煎煮提取工藝驗證試驗結果

3 討 論

中藥提取的目的是將藥材活性成分從中藥材中最大限度地分離，從而達到有效成分與雜質非活性成分的分離[20]。現代研究表明，揮發油具有抗炎、抗病毒、解熱鎮痛等作用，是中藥發揮療效的重要物質之一[21]。藥材粉碎粒度對于揮發油的提取有較大影響，本研究中飲片粉碎后的提取效果最好，1～2 cm的飲片次之，飲片不處理和飲片粉碎后包埋的效果最差，由于藥材粉碎能耗較高，易產生粉塵與噪聲，且煎煮過程易粘壁糊鍋，既耗時耗力，又污染環境；1～2 cm的飲片最后提取總量和飲片粉碎后的相差不大，且1～2 cm的飲片相對來說更易處理；故選擇1～2 cm的飲片更為合理。李志平[22]在對枳殼、木香混合藥材揮發油提取工藝的研究時對藥材的粉碎粒度研究中將藥材粉碎成8、10、12、20和24目，結果在藥材粒度10～12目時，揮發油提取率為最佳。與本研究結果相似，粗粉提取效果最好，藥材粉碎太細或太粗都不利于揮發油提取。本研究利用水蒸氣蒸餾法提取揮發油方法簡單易操作，文獻報道揮發油一般提取時間為7～10 h[23-25]，結合本試驗揮發油提取正交試驗結果，煎煮時間對提取效果有極顯著影響，因此確定揮發油提取時間為10 h。

揮發油提取工藝正交試驗結果表明，影響揮發油提取因素最大的為煎煮時間，對提取效果有極顯著影響；而浸泡時間和溶劑倍量對提取效果影響較小，各水平間差異不顯著，驗證試驗所制得的揮發油相對穩定，工藝過程可控性強、重復性較好。龐春燕等[26]在不同煎煮條件對加味銀翹方煎出率的影響的研究中考察溶劑倍量、浸泡時間和煎煮時間3個因素，同樣是煎煮時間對提取率影響最大。

水煎煮提取工藝正交試驗結果表明，在對溶劑倍量、煎煮時間和提取次數3個因素考察中，提取次數>煎煮時間>溶劑倍量。李萍等[27]在正交試驗法優選參芪益氣口服液提取工藝研究中，選定3因素相同的情況下，確定影響因素主次為提取次數>提取時間>加水量，與本研究結果一致，說明提取次數對水煎煮工藝影響最大。加味平胃口服液中可將藥材分為兩部分，一部分為蒼術、厚樸、陳皮、木香、枳殼含有揮發油成分的藥材，另一部分為苦參、甘草不含有揮發油成分的藥材。水煎煮正交試驗中的考察指標，從含有揮發油成分的藥材中選取枳殼中柚皮苷含量作為考察指標，從不含有揮發油成分的藥材中選取苦參中的苦參堿和氧化苦參堿總含量作為考察指標。因枳殼經過揮發油提取時經過了一定時間的煎煮，其中部分有效成分已被提取出來，所以將柚皮苷的權重系數設置為0.4，苦參堿和氧化苦參堿總含量的權重系數設置為0.6[28-29]。采用綜合加權評分法，計算出各次試驗的綜合評分。趙增成等[19]對銀連解毒口服液的提取工藝研究中同樣采用了加權評分的方法。本研究工廠化生產時，揮發油提取時間過久，耗能大等問題后續需結合工廠設備進一步研究。

4 結 論

本研究通過對提取方法、提取流程的試驗驗證，明確了加味平胃口服液的提取工藝為蒼術、厚樸、陳皮、木香、枳殼五味藥材切成1～2 cm大小，8倍水，水蒸氣蒸餾10 h提取揮發油，收集揮發油和餾液備用，藥渣加苦參、甘草，8倍水，煎煮1.5 h，提取3次，濾過，合并餾液及濾液，60～70 ℃減壓濃縮至1 g/mL。該工藝穩定、高效、易操作，為加味平胃口服液的規模化生產提供了工藝參考和技術借鑒。