努比亞山羊LMCD1基因生物信息學分析、真核表達載體的構建及表達

鄒劍偉，鄒菊紅，申玉建，韋 一，張叁保，連子童，徐建建，宋 穎，黃艷娜，韋英明，蔣欽楊，鄭自華

(1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004；2.廣西大學農牧產業發展研究院，南寧 530004)

LIM結構域蛋白被定義為具有雙鋅指基序的蛋白，共有氨基酸序列C-X2-C-X16-23-H-X2-C-X2-C-X16-23-C-X2-C，其中C代表半胱氨酸，X代表其他氨基酸[1]。研究發現，1個LIM結構域約由55個氨基酸和8個高度保守的氨基酸殘基組成，LIM結構域蛋白被公認為細胞調節機制的關鍵成分，是細胞生長、細胞分化和細胞骨架重塑的重要調節劑[2]。目前關于LIM蛋白的細胞功能研究已有報道[3]，但關于LIM結構域基因1(LIM domain gene 1，LMCD1)生物學功能的報道較少。基于LIM結構域之間的序列關系和蛋白質結構的分類，將LIM蛋白共分成3類：第1類蛋白具有LIM結構域相關的序列；第2類蛋白不僅有相關的LIM結構域，而且含有1個額外的短的保守基序；第3類蛋白包含的LIM結構域比第1和2類蛋白的LIM結構域更相關。LMCD1屬于第3類，有著比前兩組蛋白彼此關聯更加密切的LIM結構域[4]。據報道，LMCD1是最初由Lin11、Isl-1和Mec-3 (LIM)中發現的鋅指基序定義的一組蛋白質中的一部分，除了2個C-端LIM結構域外，LMCD1在N-端區域包含1個富含半胱氨酸的結構域，在蛋白質的中央部分包含1個PET結構域[5-6]。

骨骼肌是人體中最具活力的組織之一，約占人體總重的40%，占人體總蛋白質含量的50%～70%。人體骨骼經歷不間斷的重塑以維持骨穩態，這主要依賴于破骨細胞的骨吸收與成骨細胞的骨形成之間的協調平衡[7-8]。LIM結構域蛋白被認為與蛋白質-蛋白質相互作用有關[9]，LMCD1基因中LIM結構域的存在提示它可能參與了骨骼肌蛋白質之間的相互作用[10-11]。據報道，骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在骨髓基質干細胞的成骨分化中發揮著關鍵作用[12-13]，LMCD1基因通過調節BMP信號促進人骨髓干細胞成骨分化，其被認為是一種新型的成骨分化調節劑，可能是骨代謝相關疾病的潛在治療靶點[14]。骨骼肌質量非常依賴于蛋白質降解和合成之間的適當平衡[15]。LIM和LMCD1可以正向調節肌肉質量，促進肌肉蛋白質的合成，調控肌纖維的大小，LMCD1基因在體內充足表達可以增加臂力，同時可降低對鈣處理的需求并減少肌肉疲勞。相反，沉默LMCD1基因的表達會損害鈣處理和力量，并在沒有明顯萎縮的情況下誘發肌肉疲勞，除此之外，LMCD1基因在骨骼肌疾病患者的骨骼肌中表達量下降[16]。

LMCD1基因在細胞生長、組織器官和骨骼肌肉發育過程中具有重要的調控作用，目前LMCD1基因在小鼠和人等物種上的研究越來越多，但在山羊上鮮見報道。努比亞山羊具有體型大、生長速度快、繁殖性能強、耐粗飼及產肉率高等特點，是著名的乳肉兼用型山羊[17]。本研究克隆努比亞山羊LMCD1基因CDS區序列并進行生物信息學分析，構建真核表達載體并檢測其表達，以期為后續研究LMCD1基因在山羊骨骼肌肉發育機制中的調控作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

3只10月齡努比亞山羊由廣西大學動物科學技術學院實習基地提供；山羊骨骼肌衛星細胞和pEGFP-N1載體均由廣西大學動物遺傳育種實驗室保存。

2×RapidTaqMasterMix酶、Solution 1、氯仿、異丙醇、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；無內毒素質粒小提中量試劑盒、Cycle Pure Kit、DNA膠回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；RNA提取試劑Trizol、pEGFP-N1載體、反轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit均購自寶生物工程(大連)有限公司；ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit、2×Phanta Max MasterMix、HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA Wiper)均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；LipofectamineTMLTX Reagent、DMEM和FBS均購自Life公司。

1.2 引物設計與合成

參考GenBank中山羊LMCD1基因預測序列(登錄號：XM_005695648.2)，根據ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit的要求，利用CE Design v.1.03引物設計軟件設計1對引物：F：5′-TCAGATCTCGAGCTCAAGCTTATGGCAAAG-GTGGCCAAGG-3′；R：5′-ATGGTGGCGACCGG-TGGATCCTCAGGAGCGTTTGGACTTGC-3′。 引物由南寧捷尼斯生物科技股份有限公司合成。

1.3 RT-PCR擴增

按照Trizol說明書提取背最長肌組織總RNA，使用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度后，反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。

以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系15 μL：2×RapidTaqMasterMix酶7.5 μL，上、下引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，加ddH2O補足體系。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸95 s，共30個循環。對PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR陽性產物。

1.4 真核表達載體 pEGFP-N1-LMCD1的構建及鑒定

用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切pEGFP-N1后，利用Cycle Pure Kit回收線性化載體。按照 ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit說明書將線性化pEGFP-N1載體及目的片段定向連接。連接體系20 μL：5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，Exnase Ⅱ 2 μL，線性化pEGFP-N1 4 μL，插入片段5 μL，ddH2O 5 μL。37 ℃孵育30 min后置于4 ℃迅速降溫。 連接后的重組質粒命名為 pEGFP-N1-LMCD1，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取單克隆菌落擴大培養并進行菌液PCR和測序驗證。按照無內毒素質粒小提中量試劑盒說明書提取pEGFP-N1-LMCD1質粒，-20 ℃保存備用。

1.5 生物信息學分析

使用DNAStar中的Seq-Man軟件對測序結果與GenBank數據庫中公布的山羊LMCD1基因序列進行比對，之后進行相似性比對并構建系統進化樹；利用ExPASy在線程序(https:∥www.expasy.org/)分析蛋白的基本理化性質及親/疏水性；利用SignalP 4.0在線程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白信號肽；利用TMHMM Server v.2.0在線程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白的跨膜結構域；利用NPS?SOPMA在線程序(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白的二級結構；利用SWISS-MODEL在線程序(http:∥swissmodel.expasy.org)預測蛋白的三級結構。

1.6 細胞培養及轉染

復蘇山羊骨骼肌衛星細胞，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合度達到90%時傳至6孔板中，待細胞融合度達到80%后轉染。將提取的無內毒素pEGFP-N1-LMCD1及pEGFP-N1質粒稀釋至濃度1 000 ng/μL，按照LipofectamineTMLTX Reagent說明書進行轉染，并設陰性對照對照。轉染后24和48 h使用Nikon T-80i倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。

1.7 實時熒光定量PCR

按照試劑盒說明提取轉染pEGFP-N1及pEGFP-N1-LMCD1質粒的山羊骨骼肌衛星細胞RNA，反轉錄合成cDNA,以其為模板進行實時熒光定量PCR檢測LMCD1基因的表達水平。根據GenBank中羊LMCD1基因預測序列(登錄號：XM_005695648.2)，利用Primer Premier 5.0軟件設計定量引物：F1：5′-ACCACTGCTTGAGCTCT-GAC-3′；R1：5′-GGTGGGATCTTTCCCTGTGG-3′；以GAPDH為內參基因，引物序列：F2：5′-CCCG-TTCGACAGATAGCCGTA-3′；R2：5′-GGTGGG-ATCTTTCCCTGTGG-3′。引物均由南寧捷尼斯生物科技股份有限公司合成。

PCR反應體系10 μL：TB Green Ⅱ酶5 μL，上、下游引物各0.3 μL，模板2.5 μL，RNase-free dH2O 1.9 μL。PCR反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣本進行3次生物學重復，運用2-ΔΔCt法計算LMCD1基因的相對表達量。采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結果以平均值±標準誤表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 LMCD1基因RT-PCR擴增與重組質粒pEGFP-N1-LMCD1構建

通過RT-PCR擴增努比亞山羊LMCD1基因目的片段，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，得到單一條帶，大小約為1 092 bp(圖1)，與預期大小相符。測序結果表明，所得基因片段大小與GenBank數據庫中預測的山羊LMCD1基因CDS序列長度一致。構建重組質粒pEGFP-N1-LMCD1后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經培養后挑取單菌落進行菌液PCR驗證，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，條帶大小約為1 092 bp，與預期結果一致。

圖1 努比亞山羊LMCD1基因PCR擴增電泳結果Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification results of LMCD1 gene in Nubian goats

2.2 生物信息學分析

2.2.1 序列比對 對獲得的陽性重組質粒進行測序，測序結果用MegAlign軟件進行分析比對，結果顯示，努比亞山羊LMCD1基因CDS區全長1 092 bp，可編碼363個氨基酸。LMCD1基因CDS區中有2處堿基發生突變(圖2)，其中974 bp處為錯義突變，C變為T，丙氨酸變成了纈氨酸；1 065 bp處為同義突變。

圖2 努比亞山羊LMCD1基因序列突變位點Fig.2 Sequence mutation site of LMCD1 gene in Nubian goats

2.2.2 相似性比對及系統進化樹構建 將LMCD1基因序列分別與GenBank數據庫中其他物種的LMCD1基因分子序列進行相似性比對，并構建系統進化樹。結果顯示，努比亞山羊LMCD1基因序列與山羊相似性最高(99.8%)，而與斑馬魚相似性最低(55.4%)，與其他物種的相似性在87.0%～98.8%之間(圖3)；馬源LMCD1分子與人源處于同一小分支，親緣關系較近，而與斑馬魚相距較遠(圖4)。相似性比對與系統進化樹結果相一致，表明LMCD1分子在不同物種中較為保守。

圖3 不同物種LMCD1基因相似性比對Fig.3 Similarity alignment of LMCD1 gene among different species

圖4 LMCD1基因系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of LMCD1 gene

2.2.3 理化性質分析及信號肽預測 使用在線程序ExPASy中的ProtParam工具分析LMCD1基因編碼蛋白的基本理化性質，結果顯示，LMCD1基因共編碼363個氨基酸，其中甘氨酸含量最高(8.8%)，天冬酰胺含量最低(1.4%)；同時包含46個帶負電荷氨基酸殘基(天冬氨酸+谷氨酸)和53個帶正電荷氨基酸殘基(精氨酸+賴氨酸)(表1)。LMCD1蛋白分子式為C1775H2818N508O533S29，原子總數為5 663，分子質量為40.73 ku。理論等電點(pI)為8.47，為堿性蛋白。半衰期為30 h；蛋白不穩定系數為51.41，為不穩定蛋白；脂肪指數為67.96。親/疏水性分析發現，LMCD1蛋白第213位賴氨酸(Lys)親水性最強(-3.289)，第197位亮氨酸(Leu)疏水性最強(1.700)(圖5)。整體看，該蛋白肽鏈大部分位于親水區域，為親水性蛋白。

2.2.4 信號肽及蛋白跨膜結構預測 利用SignaIP 4.0在線程序其信號肽進行預測，結果顯示，LMCD1蛋白無信號肽(圖6)。利用TMHMM Server v.2.0在線程序對其跨膜結構進行預測，結果顯示，該蛋白不存在跨膜區(圖7)。

2.2.5 二級結構及三級結構 利用SOPMA在線程序預測LMCD1蛋白二級結構發現，無規則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉角占比分別為53.17%、30.58%、11.85%和4.41%(圖8)。利用SWISS-MODEL在線程序預測LMCD1蛋白三級結構(圖9)，與二級結構結果一致。

表1 努比亞山羊LMCD1蛋白氨基酸組成

圖5 努比亞山羊LMCD1蛋白親/疏水性分析Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of LMCD1 protein in Nubian goats

圖6 努比亞山羊LMCD1蛋白信號肽預測Fig.6 Signal peptide prediction of LMCD1 protein in Nubian goats

圖7 努比亞山羊LMCD1蛋白跨膜結構預測Fig.7 Transmembrane structure prediction of LMCD1 protein in Nubian goats

H，α螺旋；e，延伸連；t，β轉角；c，無規則卷曲H，Alpha helix；e，Extended strand；t，Beta turn；c，Random coil圖8 努比亞山羊LMCD1蛋白二級結構預測Fig.8 Secondary structure prediction of LMCD1 protein in Nubian goats

圖9 努比亞山羊LMCD1蛋白三級結構預測Fig.9 Tertiary structure prediction of LMCD1 protein in Nubian goats

2.3 真核表達載體的構建及鑒定

利用限制性內切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切pEGFP-N1-LMCD1重組質粒，得到2個片段分別為1 092和4 733 bp(圖10)，與預期大小一致。

2.4 pEGFP-N1-LMCD1表達載體轉染骨骼肌衛星細胞

將pEGFP-N1-LMCD1、pEGFP-N1和陰性對照分別轉染骨骼肌衛星細胞，轉染48 h時在熒光倒置顯微鏡下觀察到綠色熒光；在轉染了pEGFP-N1-LMCD1、pEGFP-N1的細胞中能夠觀察到表達EGFP的細胞，而陰性對照未見熒光信號(圖11)。表明本試驗構建的pEGFP-N1-LMCD1載體在骨骼肌衛星細胞中成功表達，即pEGFP-N1-LMCD1真核表達載體構建成功。

分別提取pEGFP-N1-LMCD1和pEGFP-N1組努比亞山羊骨骼肌衛星細胞總RNA，反轉錄后進行實時熒光定量PCR檢測，結果顯示，pEGFP-N1-LMCD1組LMCD1基因表達量極顯著高于pEGFP-N1組(P<0.01，圖12)，證明pEGFP-N1-LMCD1真核表達載體成功轉入努比亞山羊骨骼肌衛星細胞并表達。

圖10 真核表達載體pEGFP-N1-LMCD1的酶切鑒定Fig.10 Enzyme digestion of eukaryotic expression vector pEGFP-N1-LMCD1

圖11 pEGFP-N1-LMCD1重組質粒轉染骨骼肌衛星細胞(100×)Fig.11 Transfection of skeletal muscle satellite cells with pEGFP-N1-LMCD1 recombinant plasmid (100×)

**，差異極顯著(P<0.01)**，Extremely significant difference (P<0.01)圖12 pEGFP-N1-LMCD1轉染努比亞山羊骨骼肌衛星細胞后LMCD1基因的表達Fig.12 Expression of LMCD1 gene of skeletal muscle satellite cells transfected with pEGFP-N1-LMCD1 in Nubian goats

3 討 論

肌肉LIM蛋白由2個相鄰的LIM結構域和1個富含甘氨酸的結構域組成[18-19]，它是骨骼肌和心肌發育的重要調節因子。LMCD1基因家族特有的LIM結構域和1個保守的富含半胱氨酸的基序主要在肌肉組織中表達[20]。目前已獲得人LMCD1基因完整CDS區，并通過輻射雜交定位將該基因定位到3p26-p24；將小鼠LMCD1基因定位到6號染色體的中心區。Northern印跡分析發現，在大多數受試的成人和胎兒組織中存在1個1.7 kb的LMCD1轉錄本，其在骨骼肌中表達量最高；LMCD1在胎兒大腦、肝臟及成人大腦、肝臟、胸腺、小腸或外周血中很少或沒有表達[6]。除此以外，LMCD1在肺臟的遠端氣道上皮、血管平滑肌和心肌中高表達，在造血和心血管組織中充當GATA功能的共激活劑，通過與GATA6相互作用限制GATA6在肺臟和心臟發育過程中的調控作用[18]。在小鼠上，LMCD1在體外和體內均能有效誘導心肌細胞肥大，而敲除該分子可防止心肌肥大。因此，LMCD1可能是新的抗肥厚策略的一個有吸引力的靶點[21]。

骨骼肌是人體中最具活力的組織之一，骨骼肌質量嚴格依賴于蛋白質降解和合成之間的適當平衡[22]。據報道，LMCD1是骨骼肌質量和功能的調節劑，正向調節肌肉質量，LMCD1表達在體內和體外增加蛋白質的合成，調控肌纖維的大小，減少肌漿網Ca2+釋放，提高肌肉的抗疲勞性[16]。目前國內對LMCD1基因的研究較少，Wang等[23]對豬LMCD1基因CDS區進行克隆和序列分析，發現其在骨骼肌和心肌中均高度表達。Wang等[24]對豬LMCD1基因外顯子3的G294A位點多態性進行了基因分型，并分析了該多態性與肉質和胴體性狀的關系，結果顯示，基因型頻率為AA>AG>GG，且AA基因型的瘦肉率和脂肪率與AG基因型的相關性接近顯著，LMCD1基因可能為豬育種中骨骼肌性狀的候選基因，而在山羊上的研究卻幾乎沒有。本研究擴增努比亞山羊LMCD1基因CDS區進行生物信息學分析，并構建其真核表達載體，為今后構建攜帶LMCD1外源基因的真核表達載體提供了數據支撐，也為后續研究LMCD1基因在山羊骨骼肌肌肉發育機制中的調控作用提供理論依據。

4 結 論

本試驗成功擴增了努比亞山羊LMCD1基因CDS區序列，長度為1 092 bp,編碼363個氨基酸；努比亞山羊LMCD1蛋白為不穩定的堿性親水性蛋白，不存在跨膜結構；成功構建了pEGFP-N1-LMCD1重組質粒并將其轉染至山羊骨骼肌衛星細胞，在細胞水平和分子水平上證實了該重組質粒成功轉入努比亞山羊骨骼肌衛星細胞并檢測到其表達。