牛病毒性腹瀉病毒E0-E2基因融合腺病毒的構(gòu)建及小鼠免疫效果評價

任 杰，林 泠，湯德元，曾智勇，王 彬，禹光美，鄭如雯，吳道義，黃 濤

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.畢節(jié)市畜牧獸醫(yī)科學研究所，畢節(jié) 551700)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染引起的牛的一種病毒性傳染病，于1946年在紐約首次發(fā)現(xiàn)[1]。現(xiàn)代養(yǎng)牛業(yè)的集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖及新品種的引進導致該病的發(fā)病率逐漸增加，目前該病已廣泛流行于全世界。據(jù)統(tǒng)計，發(fā)生該病的動物病死率可高達35%，給養(yǎng)牛業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[2-3]。當前防控該病最有效的措施仍是疫苗免疫，而在售的商品疫苗主要有減毒疫苗和滅活疫苗，由于傳統(tǒng)疫苗的局限性導致該病免疫失敗率較高，結(jié)果尚不理想，使研究針對該病新的高效疫苗成為了當前亟需解決的問題[4]。

研究表明，腺病毒載體疫苗可攜帶具有保護性抗原的基因，使相應宿主產(chǎn)生特異的免疫反應，但又不整合到宿主基因、無需佐劑，并能有效刺激機體產(chǎn)生強烈的體液及細胞免疫反應[5-7]，為BVDV基因工程疫苗的研究指引了一個新的方向。1999年，Elahi等[8]利用BVDV C蛋白基因構(gòu)建重組腺病毒，將其免疫小鼠后能產(chǎn)生特異性免疫反應，但后續(xù)并未對C蛋白基因做進一步深入研究，國內(nèi)也鮮見BVDV腺病毒載體疫苗相關(guān)報道。E0、E2基因是BVDV的囊膜糖蛋白和保護性抗原控制基因，其中E0基因具有高度保守性，在病毒正常生理活性方面發(fā)揮重要作用，而E2基因則具有保守的糖基化位點，是BVDV的主要保護性抗原蛋白和主要抗原區(qū)域與宿主細胞識別、吸附的重要部位[7-8]。與C蛋白相比，BVDV E0和E2蛋白研究更深入，且良好的抗原性也得到眾多學者的認可[9-10]。本研究結(jié)合腺病毒載體疫苗的優(yōu)勢及E0和E2蛋白良好的抗原性及高度保守性，以人腺病毒5型為載體將BVDVE0及E2基因融合后構(gòu)建重組腺病毒Ad5-E0-E2，并對其免疫效果進行綜合評估，旨在為BVDV的疫苗研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細胞及菌株 BVDVE0、E2基因克隆質(zhì)粒均由貴州大學臨床獸醫(yī)學實驗室保存；人5型腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP、AdMax腺病毒系統(tǒng)均購自北京擎科生物科技有限公司；低代次人胚腎細胞系HEK293T細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 試驗動物 6～8周齡SPF級體重18～20 g健康昆明小鼠各40只，雌雄各半(動物合格證書：No.110324210102606873),購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。文中所涉及的動物試驗研究均已通過貴州大學實驗動物倫理與福利委員會審查。

1.1.3 主要試劑 牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ、Tris、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、PVDF膜(0.45 μm、0.22 μm)25*15 cm均購自北京索萊寶科技有限公司；Hind Ⅲ、SalⅠ核酸內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；牛BVDV陽性血清、辣根過氧化物酶(HRP)、山羊抗牛IgG (H+L)二抗，細胞培養(yǎng)板96孔標準型、T25細胞培養(yǎng)瓶均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BVDV抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司；Anti-Mouse CD3ε、Anti-Mouse CD4、Anti-Mouse CD8α流式抗體均購自聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增 根據(jù)BVDVE0(GenBank登錄號：EU709763)和BVDVE2(GenBank登錄號：KX170165)基因序列設計擴增引物，其中BVDV E0-F、BVDV E2-R分別加入SalⅠ和HindⅢ酶切位點，引物序列見表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。以BVDVE0、E2基因組為模板,PCR擴增相應目的片段。PCR反應體系25 μL：2×PfuMasterMix(Dye) 12.5 μL，基因組模板2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 9 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收PCR產(chǎn)物。

表1 引物信息

1.2.2 重組穿梭載體構(gòu)建與驗證 以回收的E0、E2基因片段為模板，用引物E0-F和E2-R進行重疊延伸PCR，擴增反應條件同1.2.1，E0-E2融合基因片段預期擴增大小為1 819 bp。PCR產(chǎn)物回收后使用Hind Ⅲ、SalⅠ對E0-E2融合基因與pDC316-mCMV-EGFP進行雙酶切后回收，運用T4 DNA連接酶將回收的E0-E2融合基因片段和pDC316-mCMV-EGFP載體線性化片段連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞培養(yǎng)后，挑取陽性菌落轉(zhuǎn)液體培養(yǎng)，后期提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測序進行鑒定。 將鑒定成功的穿梭質(zhì)粒命名為pDC316-E0-E2。

1.2.3 重組腺病毒包裝 將穿梭質(zhì)粒pDC316-E0-E2與AdMax腺病毒系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1，3Cre混勻后共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中，并于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察細胞生長形態(tài)直至出現(xiàn)細胞病變效應(CPE)，待一半細胞出現(xiàn)CPE后收存于2 mL凍存管中。-80和37 ℃水浴反復凍融3次，每次10 min,渦旋1 min，釋放出腺病毒顆粒。4 ℃、12 000×g離心5 min，0.22 μm過濾收獲上清液，驗證腺病毒的包裝。將獲得的重組腺病毒命名為Ad5-E0-E2。

1.2.4 重組腺病毒Ad5-E0-E2表達鑒定 用重組腺病毒Ad5-E0-E2感染HEK293T細胞，待細胞產(chǎn)生大量CPE時收集細胞，使用裂解液使其裂解釋放腺病毒。取上清液進行12% SDS-PAGE，分離蛋白。經(jīng)轉(zhuǎn)膜后用TBST配制好的5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，取膜用TBST洗滌3次,10 min/次；1∶1 000稀釋的牛BVDV陽性血清作為一抗，4 ℃孵育過夜。取膜用TBST配制好的HRP標記的山羊抗牛IgG按1∶1 000稀釋后作二抗，37 ℃孵育2 h。用ECL發(fā)光試劑盒進行顯色曝光并拍照。

1.2.5 腺病毒滴度的測定 將純化后的病毒液進行10倍倍比稀釋，接種于96孔板中已培養(yǎng)至致密單層HEK293T細胞上，按照Reed-Muench法測定所分離病毒的滴度。

1.2.6 牛病毒性腹瀉E0-E2基因重組腺病毒免疫原性評價 選取40只6～8周齡小鼠作為評價模型，分為4組，肌內(nèi)注射、皮下注射PBS對照組和肌內(nèi)注射、皮下注射Ad5-E0-E2試驗組，記作1、2、3、4組,隔離飼養(yǎng)，每組10只，雌雄各半；按照表2免疫程序進行免疫，首免后7 d后進行二免，二免后7 d進行免疫原性檢測。

1.2.7 BVDV抗體檢測 待小鼠二免后7 d尾尖采血離心收集血清，采用BVDV抗體檢測試劑盒按照使用說明書檢測小鼠血清抗體水平。經(jīng)酶標儀測定樣品D450 nm值并計算S/P值。S/P>0.30判定為陽性，S/P<0.20判定為陰性。

1.2.8 T淋巴細胞亞群檢測 小鼠經(jīng)過首免和二免后尾尖采血收集于抗凝管中，按流式細胞儀使用步驟上機檢測。比較分析重組腺病毒首免和二免小鼠后CD4+、CD8+含量及 CD4+/CD8+變化，分別于首免、二免后1周對小鼠尾尖采血于EDTA抗凝管中。運用反向加樣法將50 μL抗凝全血加入流式試管中混勻。 取20 μL CD3+、CD4+、CD8+抗體加入試管中旋渦混勻，置于室溫避光放置20 min。加入450 μL 1*FACS溶血素混勻室溫放置10 min。再通過流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行分析。P<0.01表示差異極顯著。

表2 小鼠免疫程序

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴增結(jié)果

以 BVDVE0、E2基因組為模板擴增BVDVE0、E2基因，PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，分別在約681及1 122 bp處出現(xiàn)2條目的條帶(圖1)，與預期相符。以E0、E2基因為模板，使用引物E0-F及E2-R進行重疊延伸PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，得到大小約為1 819 bp的E0-E2融合基因(圖2)，將所得產(chǎn)物經(jīng)純化回收并送測序分析，測序結(jié)果與預期E0-E2融合基因擴增大小結(jié)果一致。

M，DL2000 DNA Marker；1，E0基因；2，E2基因M，DL2000 DNA Marker；1，E0 gene；2，E2 gene圖1 E0、E2基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of E0 and E2 genes

圖2 E0-E2融合基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification result of E0-E2 fusion gene

2.2 重組穿梭載體構(gòu)建與驗證結(jié)果

用Hind Ⅲ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶對構(gòu)建的pDC316-E0-E2進行雙酶切，結(jié)果同時出現(xiàn)1 819及5 879 bp的2條目的條帶(圖3)。經(jīng)測序分析，其結(jié)果與E0-E2融合基因及pDC316-mCMV-EGFP相符，表明穿梭質(zhì)粒pDC316-E0-E2構(gòu)建成功。

M1,DL15000 DNA Marker；1,pDC316-mCMV-EGFP；2,pDC316-E0-E2雙酶切結(jié)果；M2,DL2000 DNA MarkerM1,DL15000 DNA Marker；1,pDC316-mCMV-EGFP；2,Double enzyme digestion results of pDC316-E0-E2；M2,DL2000 DNA Marker圖3 pDC316-E0-E2酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of pDC316-E0-E2 enzyme digestion

2.3 穿梭質(zhì)粒與腺病毒共轉(zhuǎn)染包裝檢測結(jié)果

將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒pDC316-E0-E2與AdMax腺病毒系統(tǒng)骨架質(zhì)粒混勻后轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，轉(zhuǎn)染7～10 d后觀察到細胞后產(chǎn)生串聯(lián)、空泡、圓縮并脫離培養(yǎng)皿底壁等細胞病變，鏡檢細胞呈現(xiàn)綠色熒光與預期結(jié)果相符(圖4)，證明重組腺病毒Ad5-E0-E2包裝成功。

A,轉(zhuǎn)染重組穿梭質(zhì)粒的HEK293T細胞;B,HEK293T細胞對照A,HEK293T cells transfected with recombinant shuttle plasmid;B,HEK293T cell control圖4 重組穿梭質(zhì)粒pDC316-E0-E2在HEK293T細胞中轉(zhuǎn)染情況(100×)Fig.4 Transfection of recombinant shuttle plasmid pDC316-E0-E2 in HEK293T cells (100×)

2.4 重組腺病毒表達蛋白Western blotting檢測結(jié)果

Western blotting檢測果顯示，在約65 ku處出現(xiàn)特異性條帶(圖5)，說明重組病毒能正常表達目的蛋白，表達的蛋白具有良好的反應原性。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1～3，Ad5-E0-E2蛋白M，Protein Marker；1-3，Ad5-E0-E2 protein圖5 重組腺病毒的Western blotting驗證Fig.5 Western blotting verification of recombinant Adenovirus

2.5 腺病毒滴度測定結(jié)果

通過Reed-Muench法測定Ad5-E0-E2滴度為1.1×1010PFU/mL。

2.6 BVDV E0和E2基因重組疫苗免疫原性探究結(jié)果

2.6.1 BVDV抗體ELISA檢測結(jié)果 試驗組注射Ad5-E0-E2后 S/P值均>0.30,血清抗體水平為陽性，且肌內(nèi)注射組S/P值高于皮下注射組。PBS對照組S/P值<0.20，為陰性(表3)。 說明注射Ad5-E0-E2后小鼠激發(fā)BVDV抗體產(chǎn)生特異性體液免疫反應。

表3 ELISA檢測BVDV抗體S/P結(jié)果

2.6.2 T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果 首免后試驗組CD4+水平均極顯著高于PBS組(P<0.01)，二免后各組CD4+水平均有上升，但試驗組仍極顯著高于PBS對照組(P<0.01)，首免和二免后試驗組CD8+水平均極顯著低于PBS對照組(P<0.01)(表4)；首免和二免后試驗組CD4+/CD8+比值均極顯著高于PBS對照組(P<0.01)(表5)。 說明構(gòu)建的重組腺病毒能刺激機體增加CD4+T淋巴細胞含量。

表4 全血T淋巴細胞亞群CD4+和CD8+含量

表5 全血T淋巴細胞亞群CD4+/CD8+的比值

3 討 論

20世紀80年代至20世紀90年代，BVD在許多國家發(fā)生大規(guī)模感染，平均感染率可達60%以上[2-3]。近年來，國內(nèi)學者對BVD的感染發(fā)病情況做了大量調(diào)查研究，2014年李智勇等[11]采用ELISA方法檢測甘肅部分養(yǎng)殖場和屠宰場220份血清，BVDV抗體陽性率為56.36%；2016年曲萍等[12]對中國新疆、青海、寧夏、甘肅和四川的感染情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，BVD的平均感染率在60%以上；2017年陳新諾等[13]用PCR方法檢測四川和西藏地區(qū)部分牧場149份臨床癥腹瀉的牦牛糞便樣品，抗原陽性率分別為12.66%和29.14%；2019年姚志蘭等[14]檢測江浙部分地區(qū)145份具有腹瀉癥狀的犢奶牛血清，BVDV抗原陽性率為13.1%；2021年石柯等[15]運用PCR方法對貴州地區(qū)224份鼻拭子樣品檢測結(jié)果顯示，36份為抗原陽性，陽性率為16.07%。以上調(diào)查結(jié)果均表明中國BVD的發(fā)病率較高，防控形勢嚴峻。20世紀90年代中國也進行了BVDV疫苗的探索研究，但由于成本和成效等各方面的原因，目前尚無較高效和經(jīng)濟疫苗普遍投入使用。基于此，本研究利用腺病毒疫苗的高效性成功組裝了BVDVE0、E2基因重組腺病毒疫苗，以期為BVDV疫苗研究提供依據(jù)。

陳文龍[10]研究表明，BVDV侵入動物機體后損傷宿主細胞的同時改變了宿主細胞的正常生理學功能，導致細胞受到損傷和持續(xù)性感染。感染型的BVDV能引起細胞的自吞噬及細胞中BVDV的囊膜蛋白E0、E2的表達量顯著升高，結(jié)構(gòu)蛋白E0和E2免疫原性好，刺激機體的體液和細胞免疫應答，產(chǎn)生有效的抗體[16-17]。因此，本試驗在構(gòu)建BVDV重組腺病毒疫苗時選用了E0、E2基因作為融合基因。孫凡婷[18]將優(yōu)化的E0基因和截短的E2基因通過重疊延伸PCR融合，構(gòu)建BVDV E0-E2融合基因重組卡介苗，獲得的目的蛋白具有反應原性。馬小靜等[19]將BVDVE0基因和牛傳染性鼻氣管炎病(IBRV)gD基因連接到真核表達載體pVAXI-IRES中，構(gòu)建pVAXI-E0-FIRES-gD重組真核表達載體,通過免疫熒光檢測構(gòu)建的基因能成功表達，表達的蛋白接種小鼠后能產(chǎn)生抗體。 梁霄勇[20]將BVDVE0基因插入到pVAX1真核表達載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-E0，首次免疫后產(chǎn)生抗體，加強免疫后抗體水平隨之增加。本研究對不同途徑免疫動物抗體水平進行分析發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)、皮下注射Ad5-E0-E2均能產(chǎn)生較高的抗體水平；T淋巴細胞亞群檢測顯示，肌內(nèi)注射組和皮下注射Ad5-E0-E2組CD4+水平高于對照組，首免和二免CD4+/CD8+值均高于對照組，說明構(gòu)建的重組腺病毒疫苗具有較好的免疫原性。本試驗結(jié)果初步說明所構(gòu)建的重組腺病毒Ad5-E0-E2具備BVDV疫苗毒株候選條件，其本體試驗和攻毒試驗還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究以人腺病毒5型為載體將BVDV E0及E2蛋白基因進行融合后構(gòu)建重組腺病毒Ad5-E0-E2，且具有良好的反應原性和免疫原性，具備BVDV疫苗毒株的基本條件，可運用到本體動物進行試驗研究。