基于AMPK通路研究葛根素對豬前體脂肪細胞成脂分化的影響

呂香州，張 琪，李 欣，于永生

(吉林省農業科學院動物生物技術研究所，公主嶺 136100)

葛根素是從豆科植物野葛根部提取出來的一種異黃酮衍生物，在生物學中被廣泛用于治療代謝類疾病，在小鼠[1]、草原紅牛[2]前體脂肪細胞中添加葛根素能夠顯著增加脂肪細胞的誘導分化和脂質沉積。在前期研究中發現，松遼黑豬前體脂肪細胞誘導液中加入40 μmol/L葛根素能夠顯著提高細胞甘油三酯含量，并對成脂標志基因及蛋白有顯著上調作用[3]。但葛根素通過何種途徑對脂肪細胞成脂分化進行調節尚未得知。

脂肪代謝是一個由多種通路和因子參與的復雜過程，其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBPα)扮演著重要的角色，其表達量高低能夠說明脂肪細胞分化程度，因此常作為成脂標志基因[2-3]。以腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)依賴的蛋白激酶(AMPK)主導的AMPK通路也在脂肪代謝中發揮著重要的作用，AMPK蛋白是一種由3個蛋白質亞基(α、β和γ)組成的活性酶[4]，該蛋白能夠調節各種生理應激中的AMP和腺嘌呤核糖二磷酸(ADP)水平，從而直接調節所有能量消耗和產生途徑，可通過檢測AMPK各亞基(PPKAG1、PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1)的相對表達量來反映AMPK蛋白在mRNA層面的相對表達量[5-6]。AMPK蛋白作為AMPK通路核心蛋白有許多下游蛋白，其中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶是最早發現的AMPK的2個受體蛋白。HMG-CoA在機體催化甘油三酯(TG)合成過程中起限速酶作用，當AMPK被激活時，其下游受體蛋白HMG-CoA還原酶活性降低，肝臟中甘油三酯合成下調[7]。

脂肪酸合成酶(FAS)可催化相關酶聚合成長鏈脂肪酸，最終在肝細胞中以甘油三酯的形式貯存。激活的AMPK蛋白可降低FAS活性，降低游離脂肪酸(FFA)含量，從而降低甘油三酯含量[8]。下游因子ACC在AMPK作用下發生磷酸化失去活性，從而導致脂肪酸合成關鍵中間產物丙二酰輔酶A的合成減少[9]，丙二酰輔酶A由乙酰輔酶A經ACC羧化形成，其在細胞內蓄積程度將影響脂質沉積和脂肪酸氧化[10]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(PGC-1α)是一種激活線粒體脂肪酸氧化以產生熱量的分子開關，其在細胞內的表達是促進棕色脂肪譜系分化的必要過程[11]。AMPK通過調節PGC-1α刺激線粒體形成，且AMPK調節線粒體相關基因表達從而通過脂肪酸氧化和肝臟糖異生促進脂質代謝[12]，即AMPK可通過激活PGC-1α促進脂肪分解。呂香州等[3]研究發現，葛根素誘導的松遼黑豬前體脂肪細胞中ACC基因表達量顯著上調，但ACC上調是否由AMPK的變化導致并未做深層研究。

本試驗以松遼黑豬前體脂肪細胞為研究對象，通過在細胞誘導過程中添加葛根素、AMPK激活劑和抑制劑，檢測分化完全的脂肪細胞中甘油三酯含量、脂肪分化基因及蛋白相對表達量，以探究葛根素對松遼黑豬前體脂肪細胞的影響以及其與AMPK通路之間的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

葛根素購自北京索萊寶科技有限公司；青-鏈霉素、胎牛血清(FBS)、PBS、Trypsin-EDTA、Trizol Reagent、PageRuler Prestained Protein Ladder均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；胰島素(insulin)、地塞米松(DEX)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、油紅O干粉均購自Sigma公司；4%多聚甲醛購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；AICAR、CompoundC購自MedChemExpress公司；Nonfat Dry Milk、Anti-rabbit購自CST公司；PPARγ、β-actin抗體均購自愛必信(上海)生物科技有限公司；ACC、AMPK、p-AMPK(Thr172)均購自北京博奧森生物技術有限公司；甘油三酯酶法測定試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；實時熒光定量PCR LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master試劑盒購自羅氏(中國)有限公司；Western blotting所需PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%、7.5%)購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司；10×Membrane Blocking/Washing Buffer(TBST)購自北京康潤誠業生物科技有限公司；PVDF免疫印跡膜均購自默克(中國)有限科技公司。酶標儀(FC)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；實時熒光定量PCR儀(Roche 480)購自Roche公司。

1.2 松遼黑豬前體脂肪細胞分離、傳代及誘導分化

取12日齡松遼黑豬(吉林省農業科學院畜牧所提供)腹股溝脂肪組織，用75%酒精消毒清洗后在PBS中剪碎，加入0.1%膠原酶37 ℃水浴消化30 min。將消化液反復吹打并用25 μm(100目)孔徑尼龍篩網過濾，濾液1 800 r/min離心5 min，用完全培養基(DMEM+10% FBS+1%青-鏈霉素)清洗3次，加入完全培養基并置于37 ℃恒溫培養箱。分離的前體脂肪細胞每48 h更換完全培養基。待細胞長至完全匯合后吸棄完全培養基并用PBS洗去殘余培養基。加入0.25%胰酶消化2～3 min，將細胞懸液1 500 r/min離心5 min，用完全培養基吹打混勻細胞沉淀，并按1∶3進行傳代。

待傳代后的松遼黑豬前體脂肪細胞匯合度為90%時將完全培養基更換為誘導液Ⅰ(DMEM+10% FBS+0.5 mmol/L IBMX+1 μmol/L DEX+10 μg/mL胰島素)，記為第0天，48 h后將誘導液Ⅰ更換為誘導液Ⅱ(DMEM+10% FBS+10 μg/mL胰島素)。 將細胞分為對照組(Con)、葛根素組(Pue)、葛根素+AMPK激活劑AICAR組(AICAR)及葛根素+AMPK抑制劑CompoundC組(CompoundC)，對照組誘導液Ⅱ中不添加葛根素，Pue組添加40 μmol/L葛根素[3]，AICAR組添加40 μmol/L葛根素+500 μmol/L AICAR[13]，CompoundC組添加40 μmol/L葛根素+20 μmol/L CompoundC[13]。誘導液Ⅱ處理48 h后更換為完全培養基，每48 h換液，培養至第8天，收集細胞用于后續檢測。

1.3 葛根素對脂質沉積的影響

1.3.1 油紅O染色 培養至第8天，用PBS清洗3次各組松遼黑豬前體脂肪細胞，在37 ℃培養箱中用4%多聚甲醛固定30 min。用PBS清洗3次后加1 mL油紅O染色工作液，30 min后用PBS清洗3次，在倒置顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照。

1.3.2 甘油三酯濃度測定 將換液培養至第8天的各組細胞用PBS清洗2遍，用0.1%胰酶消化后將細胞收集至15 mL離心管內，1 500 r/min離心5 min，吸棄上清后加入200 μL甘油三酯裂解液，室溫裂解10 min后取上清。70 ℃加熱10 min后室溫2 000 r/min離心5 min。PBS稀釋甘油標準品為1 000、500、250 μmol/L以制作標準曲線。將不同濃度標準品、先前取得待測樣品與試劑盒內的R1、R2以4∶1混合后的工作液混合后在37 ℃培養箱中孵育30 min。用FC型酶標儀檢測550 nm處的吸光值，根據標準曲線方程計算樣品中甘油三酯濃度。

1.4 葛根素對成脂分化的影響

1.4.1 實時熒光定量PCR檢測成脂分化基因的表達 Trizol法提取培養至第8天的各組細胞的RNA，并反轉錄為cDNA，根據GenBank中各基因序列，用Primer Premier 5.0設計引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 以GAPDH為內參，檢測脂肪細胞中C/EBPα、PPARγ、ACC以及AMPK各亞基的表達量。PCR反應體系20 μL：2×SYBR Green Ⅰ10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，退火(溫度見表1) 15 s，72 ℃延伸20 s，共45個循環；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min。

表1 引物信息

續表

1.4.2 Western blotting檢測成脂分化蛋白的表達 將培養至第8天的各組細胞用PBS清洗2次后加入200 μL RIPA(含磷酸酶抑制劑)裂解液，吹打混勻并收集至1.5 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min并取上清。用BCA法測定上清中蛋白濃度，取30 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠濃度為12.5%(ACC所用凝膠為7.5%)，濃縮膠與分離膠體積之比為1∶3。80 V電壓電泳至蛋白完全穿過濃縮膠后更換電壓為120 V，待Marker分離完全后，將蛋白以200 mA電流濕轉至PVDF膜上，裁剪膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST洗膜3次，每次5 min。 一抗PPARγ(1∶1 000)、ACC(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶500)、β-actin(1∶5 000) 4 ℃搖床上80 r/min孵育過夜。TBST洗膜3次后，加二抗Anti-rabbit IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后用ECL超敏顯色液顯色。

1.5 葛根素與AMPKα分子對接預測

在NCBI上下載AMPKα氨基酸序列(登錄號：NM_001167633)，在SWISS網站上對其結構進行預測并保存PDB格式，通過Autodock Vina 1.20軟件進行分子對接預測，用PyMol 2.2軟件進行3D圖繪制，用Discovery Studio 2021軟件進行二維圖繪制。

1.6 數據統計分析

每組試驗重復3次，用SPSS 25.0進行單因素方差分析，采用鄧肯檢驗進行組間差異分析，結果以平均值±標準差表示。用Image J V1.8.0軟件對Western blotting圖像進行灰度分析，用GraphPad Prism 7.0軟件作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 葛根素對脂質沉積的影響

由圖1、2可知，與Con組相比，Pue組脂滴含量明顯上升，甘油三酯濃度顯著上調(P<0.05)；與Pue組相比，AICAR組脂滴含量減少，甘油三酯濃度顯著降低(P<0.05)，CompoundC組甘油三酯濃度無顯著變化(P>0.05)。

2.2 葛根素對成脂分化基因的影響

由圖3可知，與Con組相比，Pue組PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1、PGC-1α表達量均顯著降低(P<0.05)，Pue組C/EBPα、PPARγ、ACC表達量均顯著增加(P<0.05)；與Pue組相比，AICAR組PPKAG1、PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1表達量顯著增加(P<0.05)，AICAR組C/EBPα、PPARγ、ACC表達量均顯著降低(P<0.05)，CompoundC組PPKAG1、PPKAG2、PPKAB2表達量均顯著降低(P<0.05)，CompoundC組C/EBPα、ACC表達量均顯著增加(P<0.05)。

2.3 葛根素對成脂分化相關蛋白的影響

由圖4可知，與Con組相比，Pue組成PPARγ、ACC蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，AMPK、p-AMPK蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，且p-AMPK/AMPK顯著降低(P<0.05)；與Pue組相比，AICAR組PPARγ、 ACC蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，AMPK、 p-AMPK蛋白表達量及p-AMPK/AMPK顯著增加(P<0.05)，CompoundC組PPARγ、ACC蛋白表達量均顯著增加(P<0.05)，AMPK、p-AMPK蛋白表達量及p-AMPK/AMPK均顯著降低(P<0.05)。

2.4 葛根素與AMPKα亞基對接預測

葛根素與AMPKα最佳結合模式如圖5A所示。由圖5A可知，葛根素與GLU281、ARG265、LYS262、GLU196、HIS133之間可形成5個氫鍵。由圖5B可知，除5個氫鍵外，葛根素還可與ARG134、ILE261、PRO195之間形成5個Pi-陽離子鍵，與ASP130之間形成Pi-陰離子鍵。

圖1 不同處理組脂滴形態(200×)Fig.1 Lipid droplet morphology in different treatment groups (200×)

肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different letters superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖2 不同處理組甘油三酯含量Fig.2 Triglyceride content in different treatment groups

A，AMPK各亞基的表達量；B，成脂分化基因的表達量A,Expression of each subunit of AMPK;B,expression of adipogenic differentiation genes圖3 不同處理組AMPK各亞基及脂肪分化基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of AMPK subunits and adipose differentiation genes in different treatment groups

A，Western blotting檢測成脂分化相關蛋白的表達；B，成脂分化相關蛋白灰度分析A,The expression of adipogenic differentiation related proteins was detected by Western blotting;B,Grayscale analysis of adipogenic differentiation related proteins圖4 不同處理組成脂分化相關蛋白的表達Fig.4 Expression of lipid differentiation related proteins in different treatments

A，葛根素與AMPKα結合3D模型；B，葛根素與AMPKα結合二維模型A,3D model of puerarin and AMPKα binding;B,Two-dimensional model of puerarin and AMPKα binding圖5 葛根素與AMPKα亞基對接預測結果Fig.5 Prediction results of puerarin and AMPKα subunit docking

3 討 論

研究發現，葛根素可抑制氧化應激并改善肝線粒體呼吸功能，增加ATP的產生[14]，而此時AMP/ATP比值降低，AMPK蛋白活性降低[15]，即葛根素可通過調節ATP含量間接降低AMPK蛋白活性。在3T3-L細胞培養中添加葛根素發現，葛根素可通過PI3-AMPK通路降低3T3-L細胞中葡萄糖濃度，表明葛根素能增加3T3-L脂肪細胞胰島素抵抗模型對葡萄糖的利用從而提升脂質沉積水平[16]。在本試驗中，與對照組相比，葛根素組AMPK蛋白表達量顯著下調，成脂標志基因PPARγ與C/EBPα相對表達量顯著上調，甘油三酯濃度顯著提升，而葛根素激活劑AICAR組較葛根素組效果顯著減弱，此結果與楊維波等[16]的結果一致。但同時本試驗發現AMPK蛋白下游基因ACC表達量顯著上升，PGC-1α基因表達量顯著下降，表明葛根素或可通過不同AMPK通路對脂肪細胞脂質沉積進行調節，后續將針對AMPK蛋白對ACC、PGC-1α的影響展開試驗。

ACC主要通過可逆性磷酸化的共價修飾方式調控脂肪代謝[17]。研究發現，ACC的表達受AMPK蛋白的調控，共同形成AMPK-ACC調節通路[18]。研究表明，葛根素可通過AMPK-ACC信號通路降低2型糖尿病小鼠胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，表明葛根素可改善2型糖尿病小鼠胰島素抵抗進而提升其脂質沉積水平[19]。本試驗結果顯示，葛根素可通過上調ACC基因及蛋白的表達量促進松遼黑豬前體脂肪細胞脂質沉積。但小型動物無法有效反映大型家畜的真實情況，葛根素作為飼料添加劑對大型家畜有何效果仍需進一步研究。PGC-1α表達水平的改變與肥胖、糖尿病、脂代謝紊亂等代謝疾病密切相關[20]，且PGC-1α可通過增加線粒體內解偶聯蛋白(UCP)的表達量，從而實現白色脂肪褐色化改變[21]。最近研究發現，在2型糖尿病小鼠模型中，葛根素能通過去乙酰化酶-過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(SIRT-PGC-1α)通路下調小鼠血糖濃度[22]，而AMPK同樣可作為PGC-1α上游因子調節PGC-1α的表達量[23-24]。 本試驗通過對PGC-1α基因定量分析發現，葛根素能夠顯著下調其表達量，與徐小惠等[22]研究的結果一致，但葛根素激活劑AICAR組PGC-1α表達量與葛根素組差異不顯著，葛根素是否能通過AMPK對PGC-1α進行調控仍需進一步探究。分子對接試驗則顯示葛根素與AMPKα之間可形成5個氫鍵，5個Pi-陽離子鍵及1個Pi-陰離子鍵，多種力的作用使二者的結合趨于穩定狀態。目前已知葛根素可通過調節AMP/ATP比值間接調節AMPK磷酸化[16-17]，葛根素是否可直接作用于AMPKα亞基從而抑制Thr-172位點磷酸化仍需進一步研究。

綜上，葛根素可通過AMPK通路促進松遼黑豬前體脂肪細胞的成脂分化，該結果可為在飼糧中添加葛根素以改善豬肉肉質提供理論基礎，同時，也為進一步研究松遼黑豬脂肪的代謝調節方式提供參考。

4 結 論

松遼黑豬前體脂肪細胞誘導分化時，添加40 μmol/L葛根素能夠顯著增加脂肪細胞中甘油三酯含量，顯著上調成脂分化相關基因mRNA和蛋白的表達量，顯著下調AMPK各亞基mRNA和蛋白的表達量。 在添加AMPK激活劑AIRCR(500 μmol/L)后，40 μmol/L葛根素對AMPK的影響效果被顯著抑制。說明葛根素可通過抑制AMPK Thr172磷酸化位點的磷酸化改善松遼黑豬前體脂肪細胞脂質沉積與細胞分化能力。