中國草原紅牛PDK4基因多態性及其與肉質性狀的關聯分析

馬彥茹,于永生，曹 陽，秦立紅，趙玉民,3,4,5，吳 健,3,4,5

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118；2.吉林省農業科學院，公主嶺 130033；3.農業農村部肉牛遺傳育種重點實驗室，公主嶺 136100；4.農業農村部東北種牛性能測定中心，公主嶺 136100；5.吉林省肉牛繁育及養殖技術科技創新中心，公主嶺 136100)

肌內脂肪(IMF)是影響牛肉品質的重要因素[1]。適量的IMF可以增強肉質特性，如風味、多汁性和嫩度[2-3]。目前，消費者對牛肉尤其是肌內脂肪含量豐富的牛肉需求呈現剛性增長。中國草原紅牛是采用英國短角牛(Shorthorn)與本地牛雜交培育出的具有耐粗飼、抗病力強、適應性強等優良特性的肉乳兼用型品種[4-5]，隨著多年的培育中國草原紅牛已具有生產高檔牛肉的潛力。

丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)是丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)的4種亞型之一。線粒體丙酮酸脫氫酶復合物(PDC)催化丙酮酸的氧化脫羧，并將糖酵解與三羧酸循環和ATP產生聯系起來[6]。PDK4通過磷酸化丙酮酸脫氫酶(PDH)來滅活PDC，使丙酮酸轉化乙酰輔酶A(acetyl-CoA),進而影響糖酵解、三羧酸循環和ATP形成[7]。Rowles等[8]研究表明，在饑餓、運動和糖尿病病人中,PDK4活性在大多數組織中都會升高,而且發現在人和鼠的心臟和骨骼肌中的表達量最高。White等[9]發現，PDK4對脂肪代謝和葡萄糖代謝起重要調節作用，發現PDK4在運動中根據能量需求會發生變化，推測PDK4可以調節機體能量代謝途徑，從而影響機體運動性能。曹行等[10]通過基因多態性研究發現，PDK4基因突變與賽馬速度之間存在顯著差異，對伊犁馬耐力性能具有明顯的影響。趙偉明等[11]研究發現,PDK4基因在2種牛背膘脂肪中的表達量不同，表明PDK4基因可能與脂肪沉積相關。肉牛遺傳育種重點實驗室課題組前期通過全轉錄組測序技術檢測出大量參與肉牛脂代謝的基因，其中發現PDK4基因的表達水平隨著成脂分化天數的增加而增加(未發表)。 因此，本研究利用Sanger直接測序法分析PDK4基因多態性，并與中國草原紅牛肉質性狀進行關聯性分析,以期篩選與肉質性狀相關的分子標記，為今后中國草原紅牛的分子育種和品種改良提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用中國草原紅牛均來自吉林維多利農牧業有限公司，選取120頭20月齡閹割中國草原紅牛，該批中國草原紅牛均在同一飼養環境下飼養。

1.2 主要試劑和儀器

DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司;動物組織DNA提取試劑盒購自Axygen公司;2×TaqMaster Mix購自CWBIO公司、Quawell-Q5000 超微量分光光度計購自北京鼎盛生物科技有限公司；PCR儀購自上海伯樂生命醫學產品有限公司；DYY-6C電泳儀購自北京市六一儀器廠。

1.3 肉質性狀測定

120頭中國草原紅牛屠宰后測定眼肌面積，采集背最長肌進行熟肉率、嫩度、失水率和肌內脂肪含量等肉質性狀指標的測定，具體測定方法參照肉牛生產性能測定技術規范(NY/T 2660-2014)[12]。

1.4 DNA提取

試驗牛屠宰后采集肝臟組織，-80 ℃保存。利用DNA試劑盒提取120頭中國草原紅牛肝臟組織基因組DNA，并使用超微量分光光度計檢測DNA的濃度及純度。-20 ℃保存備用。

1.5 引物設計及合成

參考NCBI中牛PDK4基因(登錄號：NM_001101883.1)，利用Primer Primer 5.0軟件設計11對引物用于擴增其11個外顯子(表1)。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司進行合成。

表1 引物信息

續表

1.6 PCR擴增

隨機挑取20個中國草原紅牛肝臟組織DNA樣品進行混池，以此為模板對PDK4基因11個外顯子進行PCR擴增。PCR反應體系20 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×TaqMasterMix 10 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(溫度見表1)，72 ℃延伸(時間見表1)，共34個循環；72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，陽性PCR產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行Sanger直接測序。

1.7 中國草原紅牛PDK4基因多態性檢測

利用DNAMAN、Chromas軟件對測序結果進行分析比對，對有突變位點的外顯子以單個個體DNA為模板進行PCR擴增后測序，記錄測序結果，統計基因型頻率及基因頻率。

1.8 統計學分析

計算遺傳多態性指標，包括有效等位基因數(Ne)、遺傳純合度(Ho)、多態信息含量(PIC)和遺傳雜合度(He)，并利用卡方適合性檢測進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，利用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，采用鄧肯氏(Duncan’s)多重比較法分析中國草原紅牛不同基因型間肉質性狀的差異。結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 中國草原紅牛PDK4基因PCR擴增

中國草原紅牛PDK4基因11個外顯子均擴增出特異性條帶，且均與目的條帶一致。圖1為PDK4基因第8和11外顯子擴增的特異性條帶。

M,DL2000 DNA Marker；1～3，PDK4基因第8外顯子PCR擴增產物；4～6，PDK4基因第11外顯子PCR擴增產物M,DL2000 DNA Marker；1-3,PCR amplification product of exon 8 of PDK4 gene;4-6,PCR amplification product of exon 11 of PDK4 gene圖1 中國草原紅牛PDK4基因PCR產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of PDK4 gene in Chinese Steppe Red cattle

2.2 測序結果分析

通過DANMAN和Chromas軟件對測序結果進行分析，發現PDK4基因第8和11外顯子均存在突變位點。在PDK4基因第8外顯子存在1個突變位點：G57C(圖2A)，存在GG、GC和CC 3種基因型，且G57C引起了編碼氨基酸的錯義突變，由谷氨酰胺突變為谷氨酸；第11外顯子存在2個突變位點：G330T和C389T(圖2B和2C)，G330T位點存在GG、GT和TT 3種基因型；C389T位點存在CC、CT和TT 3種基因型，這兩處突變均未引起編碼氨基酸的改變。

A,G57C；B,G330T；C,C398T圖2 中國草原紅牛PDK4基因外顯子不同基因型測序峰圖Fig.2 Sequencing peaks of different genotypes of PDK4 gene exon in Chinese Steppe Red cattle

2.3 中國草原紅牛PDK4基因3個突變位點的遺傳學分析

由表2可知，中國草原紅牛PDK4基因第8外顯子的G57C位點,CC、CG和GG基因型頻率分別為0.033、0.067和0.900。C和G基因頻率分別為0.066和0.934，其中GG基因型為優勢基因型,G為優勢等位基因;第11外顯子的G330T位點,TT、GT和GG基因型頻率分別為0.100、0.333和0.567;T和G基因頻率分別為0.267和0.733，其中GG基因型為優勢基因型,G為優勢等位基因；第11外顯子的C389T位點,TT、CT和CC基因型頻率分別為0.233、0.067和0.700;T和C基因頻率分別為0.267和0.733，其中CC基因型為優勢基因型,C為優勢等位基因。卡方適合性檢驗結果顯示,中國草原紅牛G57C位點偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(P<0.05),G330T和C398T位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)。由表3可知，G57C屬于低度多態性位點(PIC<0.25)，G330T和C389T均屬于中度多態位點(0.25

表2 中國草原紅牛PDK4基因多態位點的基因型頻率和基因頻率

表3 中國草原紅牛PDK4基因多態位點的遺傳多樣性分析

2.4 PDK4基因多態性與中國草原紅牛肉質性狀的關聯分析

由表4可知,PDK4基因G57C位點GG和CC基因型個體肌內脂肪含量顯著高于GC基因型(P<0.05)，其余性狀在不同基因型間均無顯著差異(P>0.05)；G330T位點GG基因型個體肌肉嫩度顯著高于TT基因型(P<0.05)，GG和TT基因型個體滴水損失和初水分量均顯著高于GT基因型個體(P<0.05)，而肌內脂肪含量顯著低于GT基因型個體(P<0.05)；C389T位點CC和CT基因型個體失水率顯著低于TT基因型個體(P<0.05)。

3 討 論

目前，對PDK4基因的研究主要集中在癌癥、糖尿病及代謝綜合征等領域[13-18]。在家畜研究方面，有研究表明，PDK4的表達水平與蒙古馬的運動關系密切[19]，伊犁馬群體中存在的g.38973232位點多態性與耐力運動性能有極顯著影響[10]。另外，PDK4基因在卵母細胞成熟、胚胎著床、溫度適應性方面也有重要作用[20-23]，其表達量在不同品種豬的不同組織中也存在差異[24-27]。目前在牛研究領域，有研究顯示，PDK4的表達水平與泌乳早期代謝特性、肉牛背最長肌的最終pH具有一定的關聯性[28]。但PDK4基因多態性與肉牛肉質的關聯缺乏文獻報道。

Sanger測序法作為第3代分子標記技術，與傳統鑒別技術相比，其檢測的是單核苷酸的突變，突變頻率較低，遺傳穩定性相對較高[29]。本研究利用Sanger測序法對中國草原紅牛PDK4基因外顯子的多態性進行了檢測，在第8外顯子發現了G57C突變，第11外顯子上發現了G330T和C389T突變。對中國草原紅牛群體的遺傳變異程度進行了分析，發現這3個多態性位點的雜合度均低于純合度，G330T、C389T位點的雜合度接近0.4，有效等位基因數均在1.6以上，多態信息含量在0.3以上，屬于中度多態，均高于G57位點。表明G330T、C389T位點多態性相對豐富且具有一定的選擇潛力。與在早勝牛群體中鈣蛋白酶I(CAPN1)基因多態性位點的遺傳變異程度相近[30]。卡方適合性檢驗結果顯示,G57C位點偏離Hardy-Weinberg平衡狀態,這可能是持續性選擇、遺傳突變等因素造成了這一偏離。G330T和C398T符合Hardy-Weinberg平衡狀態，說明這2個位點人工選擇程度較小。中國草原紅牛PDK4基因第8外顯子在G57C位點CC基因型肌內脂肪含量顯著高于GC基因型；第11外顯子G330T位點GG基因型滴水損失和初水分量顯著高于GT基因型；GG基因型肉嫩度顯著高于TT基因型；GT基因型肌內脂肪含量顯著高于TT基因型，C389T位點CT基因型失水率顯著低于TT基因型，表明PDK4基因的多態性位點與中國草原紅牛熟肉率、嫩度、肌內脂肪、持水力等肉質性狀相關。張浩等[31]發現PDK4可影響山羊的脂質沉積。上述結果說明PDK4基因是肌肉品質相關的功能基因之一。本研究結果可為中國草原紅牛的后續選育提供一定的數據支持。

4 結 論

在中國草原紅牛PDK4基因第8和11外顯子上發現3個突變位點，分別為G57C、G330T和C398T位點，G57C位點突變引起編碼氨基酸的改變，谷氨酰胺突變為谷氨酸，屬于錯義突變，其不同基因型顯著影響中國草原紅牛的肌內脂肪含量；G330T不同基因型對中國草原紅牛滴水損失、初水分量、肉嫩度、肌內脂肪含量均有顯著影響；C389T不同基因型顯著影響中國草原紅牛的失水率。