哺乳動物體細胞核移植胚胎發育中表觀重編程的研究進展

閆業聯，張夢雅，劉秋晨，汪 薪，徐長志，宗艷峰，朱治樺，吳蘇城，宋 雨，李運生，張運海，曹祖兵

(安徽農業大學動物科學技術學院,地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省重點實驗室，合肥 230036)

體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)也稱體細胞克隆，包括去核、注核、融合和激活等步驟，SCNT能將已分化的體細胞重編程為全能性狀態，徹底改變人們對生殖發育經典理論的認識。應用SCNT技術已成功克隆非洲爪蟾、小鼠、牛等20余種動物[1]，SCNT囊胚可用來產生多能干細胞(pluripotent stem cells,PSCs)，也稱為核移植胚胎干細胞(nuclear transfer embryonic stem cells,ntESCs)，它與供體同源，可用于更新和替換損壞的細胞和組織，同時，SCNT胚胎也是一種幫助人們理解細胞記憶如何被重編程產生全能細胞的模型，顯示出SCNT在農業良種擴繁、瀕危物種保護、生物醫學以及基礎研究等方面的巨大潛力[1]。然而，SCNT效率低下、表型異常發生率高嚴重阻礙了該技術的廣泛應用。 牛的克隆效率最高，也僅為5%～20%，遠遠低于體外受精(invitrofertilized,IVF)的效率(40%～60%)[2]。此外，克隆動物常出現胎盤增生、胎盤發育不全[3]以及出生后巨胎癥[4]、免疫缺陷[5]、呼吸障礙[6]等異常現象。但是，成功克隆的動物大多可產生正常表型的后代，意味著這些異常現象主要是由表觀遺傳重編程不完全引起的，而非基因突變造成的[7]。隨著低樣本量測序技術的發展和完善，人們能夠在SCNT胚胎中檢測到更詳細的全基因組表觀遺傳修飾圖譜，進一步揭示SCNT胚胎表觀遺傳重編程中的缺陷，為提高克隆效率提供了線索[8]。作者簡述了SCNT的發展歷程，并對影響SCNT胚胎著床前發育效率的表觀遺傳事件進行總結(圖1A)，強調了一些可能影響SCNT效率的表觀遺傳標記(圖1B)，以及對一些克服表觀遺傳障礙提高克隆效率的方案進行梳理，旨在促進對SCNT相關表觀遺傳調控機制的理解，從而更有效地提高克隆效率。

圖1 SCNT胚胎發育過程中的重編程事件及其在生殖克隆中的相關障礙[1]Fig.1 Molecular mechanisms of SCNT reprogramming and its associated barriers in reproductive cloning[1]

1 體細胞核移植

1958年，Gurdon等[9]將非洲爪蟾(Xenopuslaevis)幼體腸細胞核移入去核卵母細胞，獲得了第1例SCNT動物個體。1986年，Willadsen[10]通過電融合1個卵裂球與去核卵母細胞移植入受體子宮，成功獲得了3只存活的羔羊，為哺乳動物SCNT提供了依據。1997年，Wilmut等[11]將成年芬多斯母羊的乳腺上皮細胞與蘇格蘭黑面母羊的去核卵細胞電融合，獲得了首個SCNT哺乳動物“多利”，這一里程碑式的成就開啟了克隆時代。牛、小鼠、山羊、豬、歐洲盤羊、家兔、家貓、馬、大鼠、騾子、狗、雪貂、狼、水牛、紅鹿、單峰駱駝、食蟹猴等相繼被成功克隆[12]，其中最引人矚目的是2018年食蟹猴的成功克隆[13]，再次證實了SCNT的可行性。

同時，SCNT在治療性克隆、線粒體疾病等研究中也得到了發展，2001年，Wakayama等[14]在成年小鼠體細胞克隆胚胎中分離出了具備多能性特征的ntESCs；2007年Byrne等[15]報道了在成年恒河猴皮膚成纖維細胞核移植的克隆胚胎中，成功地分離獲得了2枚ESCs，其不僅有正常的核型，且具備體內外三胚層分化的多能性；2013年，該團隊利用人胎兒皮膚成纖維細胞核移植，在克隆胚胎中成功地獲得了4枚有正常二倍體核型和具備多能性的ntESCs[16]，隨后，正常成年人[17]、糖尿病[18]及老年性黃斑變性病人[19]體細胞來源的ntESCs的相繼獲得，使得治療性克隆成為研究熱點。

2 體細胞核移植后的表觀遺傳重編程

2.1 DNA甲基化

DNA甲基化主要指發生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化過程，其產物為5-甲基胞嘧啶(5-mC)[20]，在受精胚胎中，母系和父系等位基因主要通過10-11易位(ten-eleven translocation，TET)蛋白(TET1、2、3)介導5-mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)和胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine DNA glycosylase,TDG)介導的堿基切除修復[21]這兩種DNA去甲基化途徑，來清除DNA分子上親本甲基化標記[22]，在囊胚期達到最低甲基化水平。 隨后借助DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)(DNMT3A、DNMT3B、DNMT1)建立并維持新的甲基化模式[22]。

由于供體細胞基因組DNA高度甲基化[23]，SCNT胚胎發育過程中可能也經歷著DNA甲基化的動態變化，在小鼠SCNT胚胎中發現，定位于假原核(pseudo pronucle，PPN)的TET3誘導5-mC向5-hmC的轉化[24]，在其1-細胞晚期仍存在與供體細胞相近的DNA甲基化模式[25]，到2-細胞、4-細胞階段，SCNT胚胎依然比受精胚胎甲基化水平更高[8]，發育阻滯在2-細胞和4-細胞階段的SCNT胚胎的甲基化水平分別比能夠發育到囊胚階段的2-細胞和4-細胞的甲基化水平高[26]，直到囊胚期才達到與IVF囊胚相似的甲基化水平(15.6%vs19.1%)[27]。此外，小鼠植入前SCNT胚胎中存在的異常再甲基化差異甲基化區域(re-methylated differentially methylated regions，rDMRs)，導致對合子基因組激活(zygotic genome activation，ZGA)十分重要的基因和反轉錄轉座子的錯誤表達，嚴重阻礙了克隆胚胎的正常發育[28]。綜上表明，SCNT胚胎發育過程中經歷去甲基化/再甲基化的動態變化，而一種與受精胚胎相似的DNA甲基化模式對SCNT成功重編程至關重要。

2.2 組蛋白修飾

組蛋白修飾是指真核生物的細胞核中，與DNA結合的堿性蛋白質氨基末端發生的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等共價修飾，不僅在調控染色質結構和基因表達中發揮重要作用，而且可以作為表觀遺傳標記傳遞給子細胞[29]。 然而，SCNT胚胎與IVF胚胎在組蛋白甲基化和乙酰化方面存在明顯差異[30]。

2.2.1 組蛋白甲基化 組蛋白甲基化在胚胎發育的各個階段均有重要作用[31]。研究較多的是位于基因啟動子處的轉錄激活標記組蛋白3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)，在母體基因組中，存在與部分甲基化的DNA域高度重疊的非典型H3K4me3(non-canonical form of H3K4me3,ncH3K4me3)形式，成熟卵母細胞到2-細胞早期階段的基因組沉默常伴隨著ncH3K4me3的整體顯現，過表達賴氨酸特異性去甲基化酶5b(lysine-specific demethylase 5b，Kdm5b)導致大量卵母細胞中H3K4me3顯著下調并重新激活轉錄，表明它可能參與了基因抑制[32]。在2-細胞晚期，啟動子上典型H3K4me3峰的建立會取代非典型H3K4me3，H3K4me3去甲基酶Kdm5a/b的敲低會導致胚胎難以發育到囊胚階段，并導致合子基因組激活缺陷[33]，說明及時去除H3K4me3修飾對于ZGA是必需的。

組蛋白3賴氨酸9三甲基化(H3K9me3)異常是SCNT胚胎中常見的抑制性修飾，它與異染色質的形成有關，抑制相關基因的表達[34]。在小鼠SCNT胚胎2-細胞期存在一些相對于IVF胚胎未能激活的區域，被稱為抗重編程區域(reprogramming-resistant regions,RRRs)，造成ZGA缺陷，影響克隆胚胎正常發育。在體細胞中這些RRRs中富集H3K9me3[35]，過表達H3K9me3特異性組蛋白去甲基化酶Kdm4d或在供體小鼠胎兒成纖維(mouse embryonic fibroblast，MEF)細胞中敲除Suv39h1和Suv39h2(兩種H3K9甲基轉移酶)可以去除RRRs中的H3K9me3，使得小鼠SCNT胚胎在2-細胞期正常激活基因組，顯著提高了胚胎的發育效率[35]。通過其他Kdm4家族基因改善H3K9me3修飾，也在牛[36]、食蟹猴[13]、人[19]顯示出類似的效果。雖然在SCNT中使用Kdm4d可獲得與IVF相當的植入率，但植入的SCNT胚胎只有不到15%能足期發育，而且在kdm4d處理后的SCNT胚胎中仍可觀察到胎盤異常[35]。表明H3K9me3可能主要阻礙SCNT著床前胚胎發育。

組蛋白3賴氨酸27三甲基化(H3K27me3)異常重編程會阻礙SCNT胚胎發育，H3K27me3在IVF植入前胚胎的啟動子區域缺失，在體細胞中主要富集于CpG島嶼(CGI)和CGI相關啟動子上，在母體基因組中廣泛分布[37]。在植入前后胚胎發育中均發揮關鍵作用[38]，在小鼠SCNT胚胎2-細胞中存在異常重編程，當發育到桑椹胚時來自供體細胞啟動子相關的H3K27me3基本消失，達到與IVF胚胎相似的分布模式[27]。過表達H3K27me3特異性去甲基化酶Kdm6a顯著增加了SCNT囊胚形成率，但足期發育率沒有提高，敲低Kdm6b可提高Kdm6a的表達，不僅促進了ZGA，提高了囊胚的形成率，而且提高了出生率和ntESCs的產生效率[39]。 而對胚胎植入后的影響，主要是由H3K27me3印跡基因(如Sfmbt2或其相關的microRNA簇)的印跡缺失(loss of imprint,LOI)造成的[40]。

2.2.2 組蛋白乙酰化 組蛋白乙酰化通常發生在核心組蛋白N-端堿性氨基酸集中區域的特定賴氨酸殘基上，具有增加染色質可及性，促進轉錄激活的作用[41]。Dahl等[33]對小鼠體內胚胎的研究發現，組蛋白3賴氨酸27乙酰化(H3K27ac)的基因組覆蓋范圍從卵母細胞到2-細胞胚胎均顯著增加，與啟動子H3K4me3峰的建立過程十分相似，表明這些活性標志可能共同作用介導ZGA。當供體細胞注入去核MⅡ期卵母細胞后，體細胞中核心組蛋白(H3K9、H3K14、H4K16)快速去乙酰化，在克隆胚胎激活后發生再乙酰化[30]。豬SCNT胚胎1-細胞與2-細胞期H3K18ac、H4K8ac水平均顯著低于IVF胚胎，但囊胚時期SCNT胚胎與IVF胚胎中二者水平基本一致[42]。Yang等[43]發現異常的乙酰化區域阻礙合子基因的激活，曲古抑菌素A (trichostatin A,TSA)處理和過表達雙同源盒(double homebox，Dux)(Dux)挽救異常的H3K9ac修飾，能夠明顯提高克隆小鼠的發育效率，表明正確的組蛋白乙酰化重編程同樣是提高SCNT效率的重要途徑。

2.3 組蛋白變體

當供體細胞核注入去核卵母細胞后，必須被重塑成類似于受精卵的細胞核才能保證SCNT成功[44]。受精后，主要與魚精蛋白包裝在一起的精子基因組經歷整體重塑，存在于母系的組蛋白，如H3.3(由H3f3a和H3f3b編碼)和H2AFX迅速重新包裝精子的DNA[45]。在SCNT后，進入去核卵母細胞的供體細胞染色質開始濃縮，不久后，MacroH2A(由H2afy和H2afy2編碼)從體細胞核染色質中解離，直到桑椹胚階段，MacroH2A在染色質中重新建立[46]。大多數供體細胞來源組蛋白變體在激活后5 h內消失,伴隨著這個過程，所有卵母細胞來源的H3變體(H3.1、H3.2和H3.3)、H2A組蛋白家族成員X(H2A histone family member X,H2AFX)以及卵母細胞特異性的組蛋白變體H1foo在SCNT時被迅速整合到供體細胞核中[45]。除此之外，卵母細胞獨特的核心組蛋白變體TH2A和TH2B(分別由Hist1h2aa和Hist1h2ba編碼)，在體細胞中過表達能夠誘導染色質開放并促進誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)重編程[47]。在小鼠SCNT前，敲低卵母細胞的組蛋白變體H3.3會阻礙多能基因的激活，影響胚胎發育[48]，說明組蛋白變體在SCNT重編程中具有重要作用。

2.4 基因組印跡

基因組印跡是指在胚胎發育期間，通過表觀遺傳修飾來自親本的等位基因或染色體，導致2個親本來源的等位基因有不同的表達活性，具有這種差異的基因被稱為印跡基因[49]。基因組印跡在配子形成期間被清除和建立，并在生物體的整個生命周期中保持，保證了早期胚胎的正常發育[50]。然而，基因組印跡在克隆胚胎中沒有得到有效維持，導致印跡基因異常表達[12]。

DNA甲基化是哺乳動物主要的基因組印跡，不同親本來源的等位基因調控區的差異性DNA甲基化(differentially methylated region，DMR)能夠決定及維持印跡基因的差異表達[51]。H19/胰島素樣生長因子2(insulin like growth factor 2，IGF2)是哺乳動物中典型的印跡基因簇，均受DMR調控，其父源等位基因上的DMR被甲基化，在該位點上H19沉默刺激IGF2活化和細胞生長，而母源等位基因上的H19是一種抑制因子，對IGF2表達具有順式沉默效應。研究發現，IGF2和H19的異常表達可導致克隆犢牛死亡[52]，在異常死亡的克隆豬胎盤中也檢測到IGF2和H19的表達異常[53]，在人和小鼠中，H19、IGF2和胰島素樣生長因子2受體(insulin like growth factor 2 receptor，IGF2R)等印跡基因的異常表達會導致胎兒過度生長，通過檢測DMR的DNA甲基化水平發現巨胎癥的克隆綿羊中IGF2R表達較正常胎兒顯著降低[54]。低甲基化的H19/IGF2印跡導致H19轉錄增加，抑制克隆胎兒的生長，而高甲基化的H19/IGF2印跡介導的IGF2過表達導致克隆胎兒的過度生長[12]。在小鼠SCNT植入前胚胎中印跡基因H19、母源表達3(maternally expressed 3,Meg3)、IGF2R、Achaete-Scute家族BHLH轉錄因子2(achaete-scute family bhlh transcription factor 2,Ascl2)和小核核糖核蛋白多肽N(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N,SNRPN)只有4%正常表達[55]；與常規妊娠相比，從死亡克隆妊娠和活犢分離的牛胎盤中觀察到6個印跡基因(H19、X非活性特異性轉錄本(X inactive specific transcript,XIST)、IGF2R、SNRPN、父源表達3(paternally expressed 3，PEG3)和IGF2異常表達[56]，意味著對基因組印跡機制的深入研究對改善SCNT效率具有重要意義。

除DNA甲基化之外，H3K27me3修飾是一個新的印跡基因調控機制，在胚胎著床前發育過程中，母系沉積的H3K27me3抑制至少76個基因的母系等位基因表達，其中Sfmbt2、Gab1、Smoc1、Jade1在胎盤中受H3K27me3介導的非典型印跡調控，在胎兒中丟失印跡(雙等位表達)，在小鼠SCNT胚胎囊胚期所有依賴H3K27me3的印跡基因基本上都失去了印跡狀態，成為雙等位基因表達，這可能是由于供體細胞中缺乏H3K27me3印跡標記，因為它在供體細胞來源的胚胎譜系中缺失[40]。然而，在豬和牛植入后克隆胚胎中沒有發現H3K27me3基因印跡缺失，這表明H3K27me3印跡系統可能不是跨物種保守的[57]。印跡基因Ndn和Xist在克隆牛胚胎中的異常表達與乙酰化組蛋白4賴氨酸5(AcH4K5)相關[58]，而小鼠Xist(X-inactive specific transcript)是H3K27me3調控的印跡基因的一員[59]。Xist是位于X染色體上的17 kb的長鏈非編碼RNA，參與調控X染色體失活(XCI)[60]。哺乳動物X染色體通過印跡失活和隨機失活保證雄性和雌性細胞之間X染色體編碼基因表達水平的平衡[61]。然而在小鼠SCNT胚胎中，Xist普遍高表達，導致2條X染色體異常失活，引起SCNT胚胎移植后死亡[62]。在牛[62]和豬[63]中也觀察到SCNT后異常Xist激活，與產前胚胎死亡有關，說明異常的Xist表達可能也屬于H3K27me3印跡調控的體細胞克隆障礙[64]。

2.5 染色質開放性

染色質開放性也被稱為染色質可及性，是指核大分子能夠與染色質化的DNA進行物理接觸的程度，基因的表達依賴于染色質的可及性[12]。受精后，染色質組織不同的精子和卵子都經過重編程，以獲得相似的染色質可及性，從而使2個親本等位基因的表達相等[65]。在胚胎激活后12 h內，小鼠SCNT胚胎1-細胞的染色質可及性重編程伴隨著DNase Ⅰ高敏感位點(DNase Ⅰ hypersensitive sites，DHSs)的整體缺失基本完成[66]，DHSs與基因表達呈正相關，存在于供體細胞并在克隆胚胎中重新編程，然而，供體細胞的特異性DHSs無法被重新編程到克隆胚胎的DHSs，阻礙了克隆胚胎中的基因表達[66]。另外，供體細胞的染色質狀態對轉錄重編程有重要影響，Miyamoto等[67]對非洲爪蟾的研究發現，供體細胞中沉默但已有開放轉錄起始位點的基因在SCNT后容易被激活。 Djekidel等[66]利用liDNase-seq技術研究發現DHS譜重編程與供體特異性轉錄因子(TFs)網絡向合子網絡的轉換有關，一些體細胞TFs無法與染色質分離，也可能是SCNT重編程的障礙,這其中潛在的機制需要進一步研究。

3 表觀遺傳重編程改善的策略

盡管人們已經嘗試優化SCNT程序、更換供體/受體細胞類型、改變去核與融合方法等提高克隆效率，但并未像消除表觀遺傳障礙那樣顯著提高克隆效率，因為決定克隆胚胎發育能力的關鍵之一是表觀遺傳重編程的程度[44]。目前，改善供體細胞重編程狀態最常用的方法是藥物處理或調控胚胎發育相關重要基因的表達，下文將從表觀修飾劑、組蛋白去甲基化酶、抑制Xist表達、魚精蛋白和精子RNA幾個方面進行梳理。

3.1 表觀修飾劑

Han等[68]通過在供體細胞中過表達TET3來優化SCNT胚胎的去甲基化過程，成功提高了克隆山羊的出生率(3.6%vs1.5%)。DNA甲基化轉移酶抑制劑(DNA methyltransferases inhibitors，DNMTi)(圖2A)或靶向DNA甲基化轉移酶的siRNA來修正異常的再甲基化過程可顯著提高克隆效率(圖2B)，如利用5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dc)[69]、zebularine[70]、RG108[71]處理降低基因組DNA甲基化水平可以改善克隆胚胎的發育；通過注射靶向DNA甲基化轉移酶(DNMT3a和DNMT3b)的siRNA(圖2B)，可將小鼠SCNT胚胎囊胚發育率提高近10%(48.2%vs39.5%)，且小鼠SCNT胚胎的足期發育率由0.88%提升到5.33%[28]。組蛋白去乙酰酶抑制劑(histonedeacetylase inhibitor,HDACi)能夠增加組蛋白乙酰化，打開染色質結構，有利于轉錄因子的結合，激活參與早期胚胎發育的基因[12](圖2A)。迄今為止，已發現TSA、Scriptaid、Oxamflatin、SAHA、quisinostat、丙戊酸等多種HDACi，其中TSA是抑制Ⅰ和Ⅱ類HDACs最有效、最常用的抑制劑[72]，可將小鼠克隆胚胎效率從1%提高到6%[73]。TSA和5-aza-dc共同處理SCNT胚胎，能夠極大地提高小鼠、豬克隆胚胎的發育效率[74]。此外，使用TSA和Scriptaid 2種HDACi聯合處理家兔克隆胚胎比使用單一HDACi更有利于提高克隆效率[75]。但值得思考的是，這些藥物(如HDACi和DNMTi)在整體基因組范圍內對其靶標產生作用，那它們的副作用是什么？它們在激活一些基因的同時也會抑制其他基因表達嗎？此外，這些表觀修飾劑對除小鼠之外其他物種的著床后克隆胚胎發育的影響鮮有報道，均需要進一步研究。

A，組蛋白去乙酰酶抑制劑或DNA甲基化轉移酶抑制劑處理激活后重構卵母細胞；B，注射小干擾RNA、信使RNA以及精子小RNA等方法提高克隆效率；C，構建外源性表達魚精蛋白1的體細胞；D，通過使用精子樣結構供體細胞改善核移植效率A,SCNT improvement by exposure of histone deacetylase inhibitors (HDACi) after reconstructed oocyte activationor DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi);B,SCNT improvement by Injection of siRNA,mRNA and sperm-borne small RNAs;C,Exogenous expression of Protamine 1 (Prm1) gene in the somatic donor nuclei;D,SCNT improvement by using donor cells with spermatid-like structures圖2 改善SCNT的策略Fig.2 Strategies for improving SCNT

3.2 組蛋白去甲基化酶

組蛋白賴氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylases family,Kdms)可以通過優化組蛋白修飾水平，改善克隆胚胎發育效率(圖2B)。研究發現，H3K9me3去甲基化酶Kdm4d和Kdm4b均能有效降低H3K9me3水平，使得囊胚率提高到80%以上[8]，且Kdm4d mRNA注射到SCNT胚胎中能將出生率從僅1%提高到8.7%[35]。同樣，當把H3K4me3特異性去甲基化酶Kdm5b mRNA注射到去核卵母細胞中可將小鼠囊胚率從約30%提高到50%以上，過表達Kdm4b和Kdm5b可將囊胚率提高到95%以上，并有超過11%的克隆胚胎發育成活的動物[8]，而接受Kdm4b和Kdm5b mRNA和siDNMT3a和siDNMT3b共注射的去核卵母細胞的胚胎發育率更高[28]。 靈長類動物食蟹猴(Macacafascicularis)的成功克隆得益于TSA和H3K9me3甲基化去甲基化酶Kdm4d的聯合處理[13]，證明了消除多重表觀遺傳障礙是改善SCNT重編程的有效方法。

3.3 抑制Xist表達

SCNT胚胎中普遍存在Xist高表達，造成X染色體失活機制異常，敲除或敲低小鼠克隆胚胎中Xist基因，能夠提高克隆胚胎的發育效率[76]。而將Xist敲除與Kdm4過表達相結合，可將克隆效率提高到20%以上[27]。在克隆豬早期胚胎中，Kdm4a的過表達會上調Xist的表達，因此不能提高克隆豬胚胎后期的體內發育能力[77]。不同物種間的差異提示人們對不同物種間表觀遺傳變化的準確理解對推動SCNT技術的應用十分關鍵。

3.4 魚精蛋白和精子小RNA

除了集中在卵母細胞上的研究，對精子認識的不斷深入為提高SCNT效率提供了新的策略。通過構建外源性表達魚精蛋白1的供體細胞(圖2C)，能夠產生精子細胞樣染色質和細胞骨架結構，提高SCNT囊胚率[78](圖2D)。精子攜帶的小RNA(圖2B)可降低兔SCNT胚胎8-細胞期H3K9me3水平，降低SCNT囊胚的凋亡指數，顯著提高植入前克隆胚胎的發育能力[79]。注射牛精子小RNA到SCNT胚胎中改善了α-微管蛋白K40的乙酰化和原核形成率[80]。有研究發現，精子microRNA-449b[81]、microRNA-125b[82]均在改善表觀遺傳重編程方面發揮重要作用。但相關精子因子對出生率的改善還未見報道，因此，精子因子在提升克隆效率方面仍需深入探索。

綜上所述，表觀遺傳調控是一個復雜且相互協調的網絡，它不僅局限于各種表觀遺傳的獨立調控，而且還存在精密的互相調節關系。這意味著單獨消除某一項表觀遺傳障礙，提升克隆效率的作用有限，使用多種方法以及多個角度的結合來克服SCNT過程中表觀遺傳重編程障礙[83]，是提高克隆胚胎發育能力新的方向。 而要使SCNT技術有更廣闊的應用前景，則需要人們在豬、牛等大型動物上進行更多研究。

4 小 結

近年來，隨著單細胞測序技術的應用，在發現和識別克隆胚胎發育相關的重編程因子方面取得了巨大進展，一些改善表觀重編程的策略，如組蛋白去乙酰化酶抑制劑、DNA甲基轉移酶抑制劑、組蛋白去甲基化酶以及抑制Xist表達等使克隆胚胎的發育能力獲得了顯著提升，但對克隆動物出生率的提升依然有限。一些對小鼠克隆效率提升十分有效的方法(如HDACi)在大型動物上卻不盡人意，仍需要開發適合所有物種的理想核重編程策略。除了前述的各種表觀遺傳獨立調控的機制外，它們之間存在許多相互調控的關系；不同基因組位點及不同轉錄因子的轉換模式在表觀遺傳重編程中的調控方式仍不清晰；且環境因素可能影響表觀遺傳調控，因此運用多組學分析來闡明SCNT涉及的重編程因素和機制或許是提高人們對胚胎發育的理解、改善克隆胚胎發育能力的有效途徑。

在對提高克隆效率的長期探索拓展了SCNT的應用。如節約生產種公畜的時間和費用，促進經濟和農業動物的擴繁，為保護瀕危物種提供了新方法；結合SCNT與生物反應器制作技術，產生生物反應器(乳腺生物反應器)，生產特定蛋白治療人類疾病。此外，利用SCNT可以由供體細胞產生生物個體的特點，特別是當與CRISPR/Cas9等基因組編輯技術相結合時，可以在大型動物中快速高效地制造人類疾病模型，用來篩選藥物以及研究人類疾病的發病機制。因此，克隆研究的每一次進步都會使其應用領域更加廣泛。

在未來的研究中，提高SCNT胚胎的發育效率依然是人們努力的方向，隨著多種阻礙克隆胚胎發育的障礙被揭示，進一步增加了克隆研究的復雜性，意味著僅通過單一的處理消除所有障礙是不現實的，聯合去除多重障礙可能是實現完全重編程的更有效方法。另外，與最新的測序技術以及最新的基因編輯技術結合，將會更加清晰迅速地解析表觀遺傳重編程機制，以期實現幾乎完全的重編程，從而大幅度提高克隆效率。