豬鏈球菌3型疫苗候選菌株篩選及3+9型二價滅活疫苗對小鼠免疫效果評估

李倩倩，龍云志，梁 鞏，金 清，劉錦錦，楊 柳，黃 英，余道兵，宋文博，黃 超，湯細彪

(武漢科前生物股份有限公司，武漢 430000)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種人畜共患病原菌，部分高致病性菌株不僅引起豬的腦膜炎、關節炎、敗血癥、肺炎或急性死亡等，且危害與養殖業密切相關的人群健康，引起人類腦膜炎、肺炎、感染性休克和死亡[1]。根據菌體莢膜多糖抗原性的區別，豬鏈球菌可分為35種血清型(1～34型和1/2型)，其中血清2型在豬群和患病人群中的分離率最高，血清3、7和9型分離率次之[2]。研究者對2002-2013年豬群中豬鏈球菌的血清型在全球的分布進行研究顯示，從豬的臨床病例中分離的豬鏈球菌主要血清型依次為2、9、3、1/2和7型，有15.5%的菌株無法分型，其中北美(加拿大和美國)流行的優勢血清型為2和3型，南美(巴西)主要是2和1/2型，歐洲(荷蘭和西班牙)主要是9和2型，亞洲(中國和韓國)主要流行2、3、4型等[3-4]。趙顧[5]對2017-2018年安徽省不同規模化豬場中分離的53株豬鏈球菌進行血清分型發現，3、2、8、9型的分離率依次為20.7%、18.9%、11.3%和9.4%，血清3型占有主導地位。王娟等[6]對廣東地區1 326份樣品的豬鏈球菌分離結果顯示，以2型(16.58%)、3型(9.63%)和7型(6.95%)為主，其次為9型(5.34%)。王巍[7]從四川省12個市的豬場病料中分離出34株豬鏈球菌，經PCR鑒定發現2型最多，占47.1%；7和3型分別為26.5%和11.8%。Zhang等[8]對2013-2017年的中國豬場豬鏈球菌流行率的調查結果顯示，中國豬鏈球菌主要為血清2、9和7型等，9型逐年持續增高，從2013年的12.1%升高至2017年的25.8%。不同地區優勢血清型調查結果表明，豬鏈球菌血清3和9型在中國部分地區占據一定的地位，但目前對于血清3和9型豬鏈球菌的病原學研究很少，且尚無針對這2種血清型的疫苗。因此，本研究對發病豬病料進行豬鏈球菌血清3型分離培養和鑒定，通過蠟螟幼蟲和BALB/c小鼠模型篩選疫苗候選菌株，制備豬鏈球菌3+9型二價滅活疫苗，評估其在BALB/c小鼠上的免疫保護效果，以期豐富豬鏈球菌的菌種庫，為豬鏈球菌血清3型及多血清型聯合防控提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病料及菌株 臨床病料從武漢科前生物股份有限公司診斷中心獲得。菌株ZYS為2005年四川資陽分離的豬鏈球菌血清2型菌株(SS2 ZYS),菌株YT為實驗室前期篩選到的豬鏈球菌血清9型強毒株(SS9 YT),這2株菌均由武漢科前生物股份有限公司保存；商品化豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)(武漢科前生物股份有限公司)。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰酪大豆胨固體培養基(TSA)、胰酪大豆胨液體培養基(TSB)均購自BD Biotech公司；新生胎牛血清購自內蒙古金源康生物有限公司；革蘭氏染液購自青島海博生物技術有限公司；2×M5 HiPer plusTaqHiFi PCR Mix、第三代膠紅核酸染料(M5 HiPure Next Ⅲ Gelred)均購自北京聚合美生物科技有限公司。

東勝龍PCR儀(型號：ETC811)購自蘇州東勝興業科學儀器有限公司；電泳儀(型號：DYY-8C型)購自北京六一生物科技有限公司；高速臺式離心機(型號：H1850)購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DL-CJ-2ND Ⅰ潔凈工作臺購自北京東聯哈爾儀器制造有限公司；恒溫振蕩器(SHZ-8-2)購自國華(常州)儀器制造有限公司；凝膠成像系統(型號：BG-GDSAUT0520)購自北京杰瑞恒達科技有限公司。

1.1.3 試驗動物 蠟螟幼蟲1 300只左右，體重0.2～0.3 g，購自武漢維物起源生物科技有限公司；SPF級6周齡體重18～22 g的健康雌性BALB/c小鼠330只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬鏈球菌分離鑒定 在超凈工作臺中無菌采集病料(心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、淋巴結、關節液等)接種于TSA平板(含10%新生牛血清)上，37 ℃靜置培養18～24 h。選取疑似鏈球菌形態的單菌落進行PCR鑒定、革蘭氏染色、鏡檢，選取革蘭氏染色陽性的、鏈狀的單菌落繼續在TSA平板上劃線、傳代。純化后的菌株用50%甘油保存菌液，于-20 ℃保存備用。

1.2.2 菌體PCR鑒定 參照Liu等[9]根據莢膜多糖合成基因設計豬鏈球菌血清3型分型及鑒定引物(表1)。引物均由武漢擎科生物技術有限公司合成。用無菌接種環挑取TSA平板上菌落，置于50 μL PBS中，水浴煮沸10 min,冰浴2 min后離心取上清作為PCR模板。 PCR擴增體系10 μL：模板0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×M5 HiPer plusTaqHiFi PCR Mix 5μL,用ddH2O補足10 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min；16 ℃終止反應。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物信息

續表

1.2.3 蠟螟初步篩選疫苗候選菌株 選取650只0.2～0.3 g蠟螟幼蟲隨機分為26組，24組分別注射豬鏈球菌血清3型臨床分離菌株和豬鏈球菌血清2型ZYS菌株，同時設置PBS和空白對照組，每組25只；采用蠟螟最后尾足注射，注射劑量為25 μL/只，攻菌劑量為0.8×106～5.0×106CFU/只。攻菌后置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中避光培養，持續觀察7 d，每24 h記錄蠟螟的死亡情況，蠟螟通體變黑，晃動平皿蠟螟不動即認為其死亡。該篩選試驗重復2次，選取致死率較高的菌株通過BALB/c小鼠進行復篩。

1.2.4 BALB/c小鼠篩選疫苗候選菌株 選取170只BALB/c小鼠進行3輪豬鏈球菌血清型3型強毒株篩選，隨機分為3組，分為豬鏈球菌血清3型臨床分離株組、豬鏈球菌血清2型ZYS組、PBS對照組，每組10只；第1、2、3輪篩選均采用腹腔注射，各菌株的攻菌量分別為1.0×109～2.0×109、7.0×109～9.0×108和4.0×109～5.0×109CFU/只，注射劑量為200 μL/只。攻菌后連續觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。

1.2.5 毒力基因檢測 根據參考文獻[10-12]，選擇豬鏈球菌的主要毒力因子胞外蛋白因子(epf)、溶血素(sly)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、纖連蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)、毒力相關因子(orf2)、89K毒力島、谷氨酸脫氫酶(gdh)作為鑒定基因，合成8對引物，引物信息見表1。以篩選得到的1株強毒株DNA作為模板進行PCR擴增，從而確定強毒株的基因型。

1.2.6 生長曲線測定 無菌操作臺中挑取 TSA 平板(含10%新生牛血清)上經過傳代、純化的單菌落，接種于10 mL TSB培養基(含 10%新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min 培養5～8 h，作為種子液。將種子液按1%的比例接入30 mL TSB培養基(含10%新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min培養，每1或2 h取出200 μL菌液于96孔板中，測量D600 nm值，每管重復3個孔，取平均值，繪制生長曲線。

1.2.7 BALB/c小鼠致病性試驗 將菌株種子菌液按1%的比例轉接于60 mL TSB培養基(含10%新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min培養6 h，吸取100 μL菌液進行10倍倍比稀釋，涂TSA平板，從而計算細菌密度。收集菌液，5 000 r/min離心10 min，棄去上清，用原培養基0.1倍體積的PBS重懸菌體。將40只BALB/c小鼠分為5組，每組8只，菌株設置4個濃度梯度，分別為2.2×109、2.2×108、2.2×107和2.2×106CFU/只進行腹腔注射攻毒，注射劑量為200 μL/只，同時設置PBS對照組(菌株濃度為0 CFU/只)。連續觀察7 d，記錄每組小鼠的死亡情況。

1.2.8 滅活菌株制備 將前期篩選的豬鏈球菌血清9型菌株YT和此次篩選的豬鏈球菌血清3型疫苗候選菌株進行復蘇，從TSA平板上挑取單菌落到5 mL TSB液體培養基(含10%新生胎牛血清)中，37 ℃、200 r/min培養8～9 h，作為一級種子菌液；按2%的比例將種子菌液接種于TSB液體培養基(含10%新生胎牛血清)中，培養6～8 h；培養后菌液需進行活菌計數，確定豬鏈球菌血清3型菌株和豬鏈球菌血清9型菌株YT的量；按總體積加入0.3%甲醛溶液，37 ℃滅活15 h，然后對菌液進行滅活檢測，取滅活菌液進行TSA平板和TSB液體培養，從而確定滅活是否徹底；將滅活后菌液4 ℃、8 000 r/min離心10 min獲得菌體，用生理鹽水清洗5遍，去除殘留的甲醛溶液，最后用生理鹽水調整濃度，制成所需濃縮的抗原液，濃縮抗原液中豬鏈球菌血清3型和豬鏈球菌血清9型菌株YT含量均為2×1010CFU/mL；對濃縮抗原進行無菌檢測。

1.2.9 豬鏈球菌3+9型二價滅活疫苗制備 將無菌檢測后的濃縮抗原液按豬鏈球菌血清3和9型菌株抗原液1∶1配比混合，然后將混合抗原液與Summit Poly Solution佐劑4∶1配比，從而制得豬鏈球菌3+9型二價滅活疫苗，疫苗中豬鏈球菌3和9型含菌量均為2×109CFU/mL。

1.2.10 臨床觀察 選取BALB/c小鼠30只，隨機分為3組，每組10只。其中10只腿部肌內注射豬鏈球菌3+9型二價滅活疫苗，0.2 mL/只，連續觀察7 d，同時設置空白對照組(不注射)和PBS組(注射等量PBS)。

1.2.11 免疫攻毒保護 選取BALB/c小鼠90只，隨機分為3組，豬鏈球菌3+9型二價滅活疫苗組(3+9型二價滅活疫苗組)、商品化豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2型+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)組(商品化滅活疫苗組)和陰性對照組，每組30只。每只腿部肌內注射0.2 mL相應的疫苗，陰性對照組注射等劑量的PBS，免疫14 d后進行二免。二免14 d后，分別用豬鏈球菌血清2型ZYS菌株(2.0×108CFU/只)、篩選出的豬鏈球菌血清3型強毒株(2.0×108CFU/只)和豬鏈球菌血清9型YT菌株(8.0×107CFU/只)，腹腔注射攻毒，每個菌株注射10只，攻毒后觀察7 d內小鼠的臨床癥狀和死亡數。

2 結 果

2.1 細菌分離與鑒定

病料經37 ℃靜置培養18～24 h后觀察到灰白半透明色，針尖大小的光滑呈圓形的小菌落，在強光下可見淺藍色熒光(圖1A)，革蘭氏染色呈陽性(圖1B)。血清3型特異性引物及鑒定引物PCR擴增結果顯示，分離出23株細菌均為豬鏈球菌血清3型，分別命名為KQ3-1～KQ3-23。部分PCR擴增結果見圖2。

A，分離株菌落形態；B，分離株革蘭氏染色(1 000×)A，Colony morphology of the isolates;B，Gram straining of the isolates (1 000×)圖1 臨床分離菌株菌落形態及革蘭氏染色鏡檢結果Fig.1 Colony morphology and Gram staining microscopic examination results of the clinical isolates

①A,引物thrA；B，引物cps3L。②M，DL1000 DNA Marker;1～23,23株臨床分離株;24,陰性對照(ddH2O)①A，thrA primer;B，cps3L primer.②M，DL1000 DNA Marker;1-23,23 strains of clinical isolates;24,Negative control (ddH2O)圖2 分離菌PCR鑒定Fig.2 Identification of the isolates by PCR

2.2 蠟螟篩選疫苗候選菌株

蠟螟幼蟲攻毒2次試驗結果見表2。豬鏈球菌血清2型ZYS組的死亡率高達100%，PBS對照組死亡率為4%，空白對照組死亡率為0，各臨床分離株組的死亡率不同。 選取2次篩選死亡率較高的6株菌進行后續BALB/c小鼠復篩，編號分別為KQ3-1、KQ3-4、KQ3-17、KQ3-19、KQ3-20和KQ3-22。

2.3 BALB/c小鼠篩選疫苗候選菌株

小鼠攻毒篩選試驗結果見表3，根據第1次篩選死亡時間及死亡率，發現6株菌中有2株菌的死亡率均為100%，2株菌的死亡率在90%，2株菌死亡率分別為70%和80%。隨即對死亡率>90%的4株菌進行第2、3輪篩選，根據攻菌量、死亡時間及死亡率發現KQ3-1株的致病性較強，死亡率為100%。

2.4 毒力基因鑒定

對豬鏈球菌KQ3-1株進行毒力基因擴增，結果見圖3。由圖3可知，擴增出大小分別為571、443和688 bp的gapdh、sly和gdh基因；未擴增出fbps、orf2、mrp、89K和epf基因，表明該菌株的基因型為gapdh+/sly+/fbps-/orf2-/mrp-/89K-/gdh+/epf-。

2.5 生長曲線測定

根據不同時間液體培養物中豬鏈球菌的密度變化繪制生長曲線，結果見圖4。由圖4可知，0～4 h為遲緩期，4～8 h為對數生長期，8～12 h為穩定期。表明菌株KQ3-1培養8 h左右液體培養基中細菌的密度最大，可獲得大量的細菌抗原。

2.6 BALB/c小鼠致病性試驗

試驗小鼠感染KQ3-1菌株12 h內可引起小鼠精神萎靡、扎堆、毛發聳立、運動遲緩、死亡等臨床癥狀，而對照組無明顯癥狀。攻毒7 d后，每組小鼠的死亡情況見表4。根據改良寇氏法計算，KQ3-1菌株對BALB/c小鼠的LD50為5.2×107CFU/只。

①M，DL1000 DNA Marker;1、9，gapdh基因；2、10，sly基因；3、11，fbps基因；4、12，orf2基因；5、13，mrp基因；6、14，89K毒力島；7、15，gdh基因；8、16，epf基因。②1～8，模板為ddH2O，9～16，模板為KQ3-1①M,DL1000 DNA Marker;1 and 9,gapdh gene;2 and 10,sly gene;3 and 11,fbps gene;4 and 12,orf2 gene;5 and 13,mrp gene;6 and 14,89K virulence island;7 and 15,gdh gene;8 and 16, epf gene.②1-8,Template was ddH2O;9-16,Template was KQ3-1圖3 豬鏈球菌血清3型菌株KQ3-1毒力基因檢測Fig.3 Identification of virulence genes of KQ3-1 strain

圖4 KQ3-1菌株生長曲線Fig.4 Growth curve of KQ3-1 strain

表4 豬鏈球菌KQ3-1菌株攻毒后小鼠存活情況

2.7 抗原及疫苗無菌檢測

將濃縮抗原和制備的疫苗同時用TSA和TSB培養基進行無菌檢測，結果顯示，TSA和TSB培養基中均無菌生長，空白對照的TSA和TSB培養基中均無菌生長，陽性對照的TSA和TSB培養基中有菌落生長，表明疫苗無菌檢測合格。

2.8 安全性及免疫攻毒評估

疫苗組、空白對照組和PBS組注射前后小鼠無明顯差別，精神狀況、食欲均正常，觸摸小鼠腿部注射部位無腫脹、硬塊、結節等免疫反應，持續觀察7 d全部存活，表明該滅活疫苗具有良好的安全性。

免疫后攻毒試驗結果顯示，采用豬鏈球菌血清2型ZYS菌株、豬鏈球菌血清3型KQ3-1菌株和豬鏈球菌血清9型YT菌株對陰性對照組、豬鏈球菌3+9型二價滅活苗組和豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)組攻毒后，陰性對照組死亡率分別為90%、100%和100%，豬鏈球菌3+9型二價滅活苗組死亡率分別為70%、20%和30%，商品化豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)組死亡率分別為30%、100%和90%(表5)。表明本試驗疫苗對豬鏈球菌血清2、3和9型的保護率分別為30%、80%和70%，而商品化的滅活疫苗對豬鏈球菌菌血清2型保護效果為70%，對3和9型的保護率分別為0和10%；因此，研發的豬鏈球菌3+9型二價滅活苗能有效預防豬鏈球菌血清3和9型強毒株的感染。

表5 豬鏈球菌3+9型二價滅活疫苗效力試驗結果

3 討 論

目前豬鏈球菌疫苗主要分為滅活疫苗、弱毒活疫苗和亞單位疫苗。市售商品化疫苗主要豬鏈球菌病蜂膠滅活疫苗、豬鏈球菌病滅活疫苗(豬鏈球菌2型+馬鏈球菌獸疫亞種)、豬敗血性鏈球菌病活疫苗、豬鏈球菌病-副豬嗜血桿菌病二聯滅活疫苗、豬鏈球菌病滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)及豬鏈球菌滅活疫苗(2型，HA9801株)等[13]。由于豬鏈球菌血清型眾多，滅活疫苗和弱毒活疫苗對多個血清型的保護能力有限，使得保護效果不理想。而單獨以1種或幾種毒力因子制成的亞單位疫苗不能起到完全的免疫保護效果，因此，滅活疫苗仍有著不可替代的作用。近年來豬鏈球菌血清2型在中國廣泛存在并流行，成為當前危害中國養豬業的主要病原之一，也給公共衛生安全帶來威脅。同時，豬鏈球菌血清3和9型也是優勢血清型，呈上升的趨勢[5-7,14-15]，而針對豬鏈球菌血清3、9型尚無相關的疫苗，給豬鏈球菌的防控帶來了風險。因此，需要開發一種能預防豬鏈球菌血清3和9型的疫苗解決上述問題。

豬鏈球菌的生物學特性隨著菌株和培養條件的變化而有所不同，不同菌株之間往往差異很大，分離新的致病性菌株，篩選免疫原性和安全性良好的疫苗菌株至關重要[16]。前期實驗室已成功分離和篩選出豬鏈球菌血清9型的疫苗候選菌株YT，而豬鏈球菌血清3型疫苗候選菌株尚未獲得。因此，本研究基于武漢科前生物股份有限公司診斷中心平臺，以來自全國各地豬場送檢的病料為材料，分離鑒定豬鏈球菌。通過對分離的細菌進行形態學觀察、革蘭氏染色、PCR鑒定確定菌種和血清型，獲得23株豬鏈球菌3型臨床分離株。進一步從23株豬鏈球菌菌株中鑒定出強毒株。動物模型是判斷細菌毒力的重要工具，目前國際上尚無公認的標準的豬鏈球菌感染模型，而各個研究團隊根據研究目的的不同建立了不同的動物模型。常用的動物感染模型主要包括斑馬魚模型、小鼠模型、豚鼠模型和仔豬模型[17]。此外，蠟螟幼蟲已成功用于人類和動物傳染病的研究，Velikova等[18]開發了該動物模型應用在豬鏈球菌毒力的評估。通過豬鏈球菌感染蠟螟幼蟲、仔豬和斑馬魚模型，發現豬鏈球菌血清2型致病菌株對于蠟螟幼蟲的毒力評估與仔豬和斑馬魚模型一致。蠟螟幼蟲模型簡單、快速、精確、成本低，可大規模使用，適合作為豬鏈球菌的感染模型。因此，通過蠟螟幼蟲和BALB/c小鼠模型對23株豬鏈球菌血清3型進行篩選，篩選到1株強毒株KQ3-1。

為進一步了解KQ3-1株的生物學特性，試驗對其生長曲線、毒力因子和致病性進行研究，結果顯示，疫苗候選菌株KQ3-1培養8 h左右液體培養基中細菌密度最大，可獲得大量的細菌抗原。毒力基因檢測發現，基因型為gapdh+/sly+/fbps-/orf2-/mrp-/89K-/gdh+/epf-。Vecht15]研究發現，從發病豬體內分離的鏈球菌80%是mrp+/epf+型，而健康豬中86%是mrp-/epf-型[19]。KQ3-1株雖不攜帶強致病毒力基因mrp和epf基因，但BALB/c小鼠的致病性試驗結果表明，KQ3-1株的致病性很強，LD50為5.2×107CFU/只。 不同毒力基因的組合對菌株的致病性具有一定影響[20]，KQ3-1攜帶3個毒力基因，對于每個基因在菌株致病性中發揮的作用仍需進一步探究。

利用本試驗篩選的豬鏈球菌血清3型疫苗候選菌株KQ3-1和豬鏈球菌血清9型疫苗候選菌株YT制備的豬鏈球菌3+9型二價滅活疫苗對血清3和9型菌株的攻毒保護率為80%和70%，而商品化豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)對血清3型菌株攻毒無保護效果，對血清9型菌株攻毒保護率為10%。而本試驗制備的疫苗對血清3和9型的保護效果仍有待提高。疫苗制備中佐劑的選擇和滅活方式也起著關鍵性的作用，選擇合適的滅活方式和佐劑能將抗原的免疫原性發揮到最佳狀態[21]。下一步試驗將對不同的佐劑和滅活方式進行篩選，從而制備對豬鏈球菌血清3和9型具有更好免疫效果的疫苗。

4 結 論

本研究利用蠟螟和BALB/c小鼠模型從23株臨床豬鏈球菌血清3型菌株中篩選出1株疫苗候選菌株KQ3-1，進而結合前期篩選的豬鏈球菌血清9型疫苗候選菌株制備了豬鏈球菌3+9型二價滅活疫苗，證明其在BALB/c小鼠模型上能有效預防血清3和9型強毒菌株的感染。