BVDV 1型和2型TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

麻寶藝，盛陳艷，劉宏瑩，馬青霞，汪婷婷，李健明，時(shí) 坤，杜 銳,3,4，冷 雪

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118;3.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130118；4.吉林省梅花鹿高效養(yǎng)殖和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)技術(shù)工程研究中心，長(zhǎng)春 130118)

牛病毒性腹瀉(黏膜病)(bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的牛最常見(jiàn)的重要病毒性疾病之一[1]。1946年，美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)BVD，之后相繼在其他國(guó)家流行[2]。中國(guó)于1980年首次發(fā)現(xiàn)該病，并于1983年在胎牛血清中成功分離并鑒定出BVDV[3]。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報(bào)動(dòng)物疫病，在各大洲處于流行階段[4]。BVD廣泛存在于世界范圍內(nèi)，其流行給養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)了極大的影響。

BVDV是一種小型的，有包膜的單股正鏈RNA病毒，約12.5 kb，是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員[5]。1994年，Ridpat等根據(jù)病毒基因組5′-非翻譯區(qū)(5′-UTR)序列的區(qū)別，將BVDV分為1(BVDV1)和2(BVDV2)兩種基因型[6]。近年來(lái)相繼報(bào)道了另外1個(gè)基因型，其基因序列與已知BVDV1和BVDV2有較大的差異，被命名為“Ho-like”瘟病毒，也被稱(chēng)為BVDV 3型(BVDV3)[7]。中國(guó)分離鑒定的BVDV以BVDV1為主，但近年來(lái)出現(xiàn)了關(guān)于中國(guó)牛群感染BVDV2型的報(bào)道[8]。本研究根據(jù)BVDV1和BVDV2的5′-UTR區(qū)計(jì)特異性引物，構(gòu)建基于TaqMan探針的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，用于BVDV1和BVDV2的鑒別檢測(cè)，有助于發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期某地區(qū)流行的BVDV的主要基因型，為預(yù)測(cè)BVDV的流行趨勢(shì)及中國(guó)BVDV流行病學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 毒株和臨床樣品

BVDV1和BVDV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性毒株、牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis，IBRV)、牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)和牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室保存。156份牛鼻拭子和糞拭子樣品采自吉林省部分牛場(chǎng)。

1.2 主要試劑

病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司;PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 Plus Dye)、2×TaqMan Fast qPCR預(yù)混液、pMD19-T載體、DL5000 DNA Marker、瓊脂糖、核酸染料、回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 引物與探針設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上收錄的53株BVDV1和42株BVDV2的5′-UTR的保守序列設(shè)計(jì)2對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針(表1)。引物和探針均由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

1.4 重組陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

根據(jù)商品化RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，從BVDV1和BVDV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性毒株中提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：PremixTaqTM12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)鑒定正確的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。目標(biāo)片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定，獲得BVDV1和BVDV2陽(yáng)性質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)核酸測(cè)定儀來(lái)測(cè)定重組陽(yáng)性質(zhì)粒的濃度，使用樣品拷貝數(shù)計(jì)算公式來(lái)?yè)Q算陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。重組陽(yáng)性質(zhì)粒于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物及探針序列

1.5 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.5.1 退火溫度的優(yōu)化 試驗(yàn)擴(kuò)增程序中的退火溫度設(shè)置為55.0、56.0、57.0、58.0、58.9和59.5 ℃ 6個(gè)溫度，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，根據(jù)循環(huán)閾值(Ct值)和熒光強(qiáng)度綜合判定最佳退火溫度。

1.5.2 引物、探針濃度的優(yōu)化 將引物和探針?lè)謩e稀釋為0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L 5個(gè)不同濃度，進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqMan Fast qPCR預(yù)混液10 μL，qPCR-BVDV1、qPCR-BVDV2引物和探針各1 μL，BVDV1和BVDV2重組陽(yáng)性質(zhì)粒混合模板2 μL，ddH2O 2 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，57 ℃ 40 s，共45個(gè)循環(huán)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，根據(jù)Ct值和熒光強(qiáng)度綜合判定最佳的引物和探針濃度。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將BVDV1和BVDV2重組陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)O(shè)置6個(gè)稀釋梯度(103～108拷貝/μL)，將其作為反應(yīng)模板，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，生成Ct值，分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果。

1.7 特異性試驗(yàn)

為了排除BVDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性毒株與其他牛病毒病原體之間的交叉反應(yīng)性，提取IBRV、BRSV和BPIV3的核酸，以BVDV1、BVDV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性毒株及IBRV、BRSV、BPIV3的DNA或cDNA作為模板，并設(shè)立陰性對(duì)照，進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.8 敏感性試驗(yàn)

對(duì)重組陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋(100～108拷貝/μL)，確定該方法的最低檢出限(LOD)，來(lái)評(píng)估TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)與普通PCR進(jìn)行靈敏度的比較。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

為了檢測(cè)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性，分別使用10倍倍比稀釋的重組陽(yáng)性質(zhì)粒(103、105和107拷貝/μL)作為模板，將已經(jīng)稀釋好的6組不同濃度重組陽(yáng)性質(zhì)粒在相同條件下再進(jìn)行3次試驗(yàn)作為批間重復(fù)性檢驗(yàn)，并對(duì)每個(gè)濃度進(jìn)行3次的批內(nèi)重復(fù)性檢驗(yàn)。通過(guò)將每個(gè)測(cè)試樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)除以平均值，計(jì)算出批間變異系數(shù)和批內(nèi)變異系數(shù)[9]。

1.10 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)臨床采集的不同年齡段(1～6、6～18和18月齡以上)牛群的鼻拭子和糞拭子共156份樣品進(jìn)行BVDV1和BVDV2雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，比較不同年齡牛BVDV的感染情況，同時(shí)采用OIE國(guó)標(biāo)普通PCR檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)[10]。

2 結(jié) 果

2.1 重組陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建

應(yīng)用合成的特異性引物BVDV1-F/R和BVDV2-F/R分別對(duì)BVDV1和BVDV2進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，片段大小約為379和321 bp(圖1)，與預(yù)期大小相符。將目的片段克隆至pMD19-T載體中，測(cè)序正確，成功構(gòu)建BVDV1和BVDV2重組質(zhì)粒。經(jīng)計(jì)算BVDV1和BVDV2的拷貝數(shù)分別為3.63×1010和9.5×1010拷貝/μL。

2.2 BVDV1和BVDV2 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR優(yōu)化結(jié)果，BVDV1和BVDV2最適退火溫度均為57.0 ℃(圖2)。BVDV1和BVDV2的引物最適濃度均為0.5 μmol/L，探針最適濃度均為0.3 μmol/L(圖3)。

M，DL500 DNA Marker；1、2，BVDV1；3、4，BVDV2；5，陰性對(duì)照M，DL500 DNA Marker;1 and 2，BVDV1；3 and 4，BVDV2；5，Negative control圖1 BVDV1和BVDV2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of BVDV1 and BVDV2

1～6，BVDV1退火溫度為57.0、56.0、59.5、58.0、55.0和58.9 ℃1-6，The annealing temperatures were 57.0,56.0,59.5,58.0,55.0 and 58.9 ℃,respectively圖2 BVDV1(A)和BVDV2(B)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR不同退火溫度的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 TaqMan Real-time PCR amplification results of BVDV1 (A) and BVDV2 (B) with different annealing temperatures

圖3 BVDV1(A)和BVDV2(B) TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR不同引物、探針濃度的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 TaqMan Real-time PCR amplification results of BVDV1 (A) and BVDV2 (B) with different primer and probe concentrations

2.3 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將BVDV1和BVDV2重組陽(yáng)性質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍倍比稀釋(103～108拷貝/μL)，建立TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，Ct值和BVDV1重組陽(yáng)性質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間呈線(xiàn)性相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：Y=-3.54X+37.36(R2=0.990)，擴(kuò)增效率(E)為92%；Ct值和BVDV2重組陽(yáng)性質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間呈線(xiàn)性相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：Y=-3.18X+35.95(R2=0.997)，擴(kuò)增效率(E)為106%。

2.4 特異性試驗(yàn)

以BVDV1、BVDV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性毒株及IBRV、BRSV、BPIV3的DNA或cDNA作為模板檢測(cè)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，除BVDV1和BVDV2模板外，均未檢測(cè)到其他擴(kuò)增信號(hào)，表明建立的檢測(cè)方法特異性良好。

圖4 BVDV1和BVDV2 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 The standard curve of TaqMan Real-time PCR of BVDV1 and BVDV2

1～5，分別為BVDV1、BVDV2、IBRV、BRSV和BPIV31-5，BVDV1，BVDV2，IBRV，BRSV and BPIV3，respectively圖5 BVDV1和BVDV2 TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.5 Specificity amplification curve of TaqMan Real-time PCR of BVDV1 and BVDV2

2.5 敏感性試驗(yàn)

將BVDV1和BVDV2重組陽(yáng)性質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍倍比稀釋(100～108拷貝/μL)，進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果顯示，BVDV1和BVDV2重組陽(yáng)性質(zhì)粒檢測(cè)下限均為10拷貝/μL(圖6)。BVDV1和BVDV2常規(guī)PCR檢測(cè)下限均為103拷貝/μL(圖7)。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

使用濃度為103、105和107拷貝/μL的BVDV1和BVDV2重組陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過(guò)批間試驗(yàn)和批內(nèi)試驗(yàn)來(lái)評(píng)估建立檢測(cè)方法的可重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表2、3。由表2、3可知，批內(nèi)變異系數(shù)為0.17%～1.44%；批間變異系數(shù)為0.94%～2.71%。說(shuō)明該檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

2.7 臨床樣品檢測(cè)

BVDV1和BVDV2雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，156份樣品中共檢測(cè)出BVDV陽(yáng)性樣品36份，陽(yáng)性檢出率為23.1%，其中BVDV1 28份，BVDV2 8份(表4)。使用OIE國(guó)標(biāo)普通PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，檢出BVDV陽(yáng)性樣品29份，檢出率為18.6%。說(shuō)明所建立的雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法敏感性高于普通PCR，更適用于臨床檢測(cè)。

分析不同年齡牛BVDV的感染情況，根據(jù)采樣牛的年齡分為1～6、6～18和18月齡以上牛。由表4可知，1～6月齡牛的陽(yáng)性率為35.0%(14/40)，6～18月齡牛的陽(yáng)性率為13.0%(7/54)，18月齡以上牛的陽(yáng)性率為24.2%(15/62)。

1～9，分別為108、107、106、105、104、103、102、101和100拷貝/μL1-9，108,107,106,105,104,103,102，101 and 100 copies/μL，respectively圖6 BVDV1(A)和BVDV2(B)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感度擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.6 Sensitivity test curve of TaqMan Real-time PCR amplification of BVDV1 (A) and BVDV2 (B)

M，DL500 DNA Marker；1，陰性對(duì)照；2～10，108、107、106、105、104、103、102、101和100拷貝/μLM，DL500 DNA Marker；1，Negative control；2-10，108,107,106,105,104,103,102,101 and 100 copies/μL，respectively圖7 BVDV1(A)和BVDV2(B)普通PCR敏感性試驗(yàn)Fig.7 Sensitivity test of PCR amplification of BVDV1 (A) and BVDV2 (B)

表2 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

表3 批間重復(fù)性試驗(yàn)

表4 不同年齡牛BVDV檢測(cè)情況

3 討 論

BVDV是導(dǎo)致牛的胃腸道、呼吸道和生殖系統(tǒng)疾病相關(guān)的重要病原體，目前已在世界各地廣泛流行和蔓延，特別是在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家，其對(duì)中國(guó)牛養(yǎng)殖業(yè)也造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。不同健康狀況的牛表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，主要包括免疫抑制、繁殖障礙、腸炎、免疫耐受與持續(xù)感染、急性或慢性黏膜病等[11]，甚至?xí)p傷機(jī)體免疫系統(tǒng)引發(fā)其他病毒、細(xì)菌混合感染，特別是懷孕早期，血清抗體陰性的母牛一旦感染，常通過(guò)胎盤(pán)使胎兒產(chǎn)生免疫抑制[12]，如果小牛正常產(chǎn)出，一出生便為持續(xù)感染(persistent infection，PI)牛。因?yàn)镻I牛體內(nèi)始終帶毒，且血清中無(wú)保護(hù)性抗體，極易傳染給小牛，由此造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，牛群中BVDV的篩查對(duì)于牛場(chǎng)的健康發(fā)展尤為重要。

由于病毒感染的性質(zhì)，目前并沒(méi)有完全治愈病毒感染動(dòng)物的治療方法[5]。現(xiàn)階段，疫苗接種也并未達(dá)到消除BVDV相關(guān)臨床疾病以及明顯降低其發(fā)病率的理想效果。一個(gè)高效準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于發(fā)病牛的診斷和牛場(chǎng)生物安全防控尤為重要[13]。目前，BVDV檢測(cè)方法主要有病毒分離、抗原檢測(cè)、免疫組織化學(xué)法等病原學(xué)診斷技術(shù)；以病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)為代表的血清學(xué)診斷技術(shù)；RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)診斷技術(shù)[13]。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有重復(fù)性好、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。王克棟等[14]建立了BVDV1和BVDV2雙重RT-PCR檢測(cè)方法，比普通PCR更方便快捷。王艷杰等[10]建立了用于檢測(cè)BVDV1和BVDV2的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，該方法重復(fù)性較好，但敏感性較低。彭雪松等[15]建立了BVDV基因分型三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，該方法能同時(shí)檢測(cè)BVDV 3種基因型，但重復(fù)性相對(duì)較低。BVDV 5′-UTR全長(zhǎng)360～386 bp，通過(guò)自身折疊形成特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)BVDV基因組的翻譯和復(fù)制，是BVDV基因組最保守的部分[16]。因此，常根據(jù)5′-UTR的序列合成引物檢測(cè)BVDV或用來(lái)對(duì)BVDV分型[6]。而由于BVDV是單股正鏈RNA病毒，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極其容易變異從而不斷出現(xiàn)新毒株。因此本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)分離毒株及GenBank中具有代表性的95個(gè)BVDV的5′-UTR設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針，有效提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。且與其他檢測(cè)方法相比，本研究建立的檢測(cè)方法既保證了實(shí)時(shí)熒光定量PCR高效、便捷等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有較高的敏感性(檢測(cè)下限為10拷貝/μL)、特異性(對(duì)IBRV、BRSV和BPIV3不產(chǎn)生特性擴(kuò)增)和重復(fù)性(變異系數(shù)<3%)。

流行病學(xué)研究表明，BVDV在西藏地區(qū)及山東、青海、云南及吉林省的陽(yáng)性率分別為27.14%[17]、34.58%[18]、22.19%[19]、16.45%[20]及19.21%[21]，其中在山東省陽(yáng)性率較高。本研究對(duì)吉林省部分牛場(chǎng)采集的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，總體陽(yáng)性率為23.1%(36/156)，其中BVDV1陽(yáng)性率為17.9%，BVDV2陽(yáng)性率為5.1%。不同年齡牛BVDV感染情況分析結(jié)果表明，1～6月齡牛的陽(yáng)性率為35.0%，6～18月齡牛的陽(yáng)性率為13.0%，18月齡以上牛的陽(yáng)性率為24.2%。由此可見(jiàn)，1～6月齡的小牛在3個(gè)年齡段中感染率最高。綜上表明，BVDV在中國(guó)流行范圍較廣，且陽(yáng)性率有逐年增加的態(tài)勢(shì)。因此，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)BVDV的檢測(cè)和防控，并對(duì)BVDV2給予高度重視。

4 結(jié) 論

本研究建立的BVDV1和BVDV2型TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可快速、準(zhǔn)確地鑒別BVDV1和BVDV2感染，為該病的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效手段。