牡荊總黃酮提取工藝優化及其對產氣莢膜梭菌抑菌活性研究

李亞暉，羅勝軍，唐興剛，袁明貴，魏琦麟，婁 華，向 蓉,3

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528225；2.廣東省農業科學院動物衛生研究所，農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東省中獸藥工程技術研究中心，廣州 510640；3.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525000)

天然植物富含多種活性成分，如黃酮、多糖、生物堿、皂苷、揮發油等[1],這些活性物質大多具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和免疫調節等生物活性[2]，且具有天然環保無殘留，毒副作用小等優點[3]，在當前養殖業減抗替抗的形勢下成為替抗產品最佳選擇之一，在養殖中已有大規模使用[4]。牡荊屬植物(VitexL.)是馬鞭草科(Verbenaceae)牡荊亞科植物[5]，在中國分布廣泛，種類多樣性豐富。牡荊屬植物已被證實有抗炎鎮痛、抗氧化、祛痰平喘、抑菌等藥理作用[6]。國內外學者在牡荊屬植物，尤其是該屬穗花牡荊、黃荊等的化學成分和生物活性方面做了大量的研究，發現牡荊屬植物含有大量的黃酮類[7]，是牡荊屬植物中重要的活性成分，包括黃酮類(L1)和查耳酮(L2)等結構類型[8]。而目前在中國分布廣泛的牡荊(VitexnegundoL. var.cannabifolia(Sieb. et Zucc.) Hand.-Mazz. (V.negundo))相關研究較少，其活性研究也不夠深入。廣東省農業科學院動物衛生研究所獸藥研發中心課題組前期針對牡荊提取物化學成分分析的研究中已確定的成分以黃酮類化合物為主，鑒于植物中總黃酮易溶于有機溶劑[9]，本研究采用乙醇加熱回流法提取牡荊中總黃酮，以乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比為因素，運用正交試驗，確定牡荊提取物的最佳制備工藝，并探討牡荊提取物對產氣莢膜梭菌的抑菌活性，為牡荊提取物制劑的制備及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物與菌株

牡荊采自廣東省河源市，蘆丁對照品(批號：A05GB144263)購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%；產氣莢膜梭菌G型為廣東省農業科學院動物衛生研究所獸藥研究室凍存。

1.2 主要試劑及儀器

亞硝酸鈉 (批號:20120314)、硝酸鋁(批號:21050903-2)、氫氧化鈉(批號:200514)、乙醇(批號：2019120203)、液體硫乙醇酸鹽培養基(批號：028030)、胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂基礎(批號：028020)均購自廣州市叢源儀器有限公司。

UV1780紫外分光光度計購自蘇州島津儀器有限公司；00000246號萬分之一電子天平購自北京賽多利斯科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋購自常州奧華儀器有限公司；DHZ-3D旋轉蒸發儀購自重慶雅馬拓科技有限公司；SHZ-DⅢ循環水真空泵購自鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 溶液配制

精密稱取蘆丁標準品10.00 mg，置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇適量，水浴40 ℃使其溶解，冷卻至室溫后加60%乙醇至刻度，搖勻，得蘆丁儲備液。精密量取5.00 mL蘆丁儲備液，置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁標準品溶液(含蘆丁0.2 mg/mL)。精密稱取牡荊粉末1.00 g，加入80%乙醇溶液50 mL，加熱回流，過濾取上清液棄藥渣，即得供試品溶液。

1.4 總黃酮含量的測定

參考向蓉[10]方法，利用NaNO2-AL(NO3)3-NaOH顯色法進行總黃酮含量的測定。 精密量取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL蘆丁標準品溶液置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.00 mL，加5%亞硝酸鈉(50 mg/mL)溶液1.00 mL，混勻，放置6 min；再加10%硝酸鋁溶液(100 mg/mL)1.00 mL，搖勻，放置6 min；加NaOH溶液(40 mg/mL)10.00 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白。 在510 nm波長下測量吸光度。以吸光度為縱坐標、蘆丁標準液的濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程。

精密量取一定體積的供試品溶液,按上述顯色法操作后測定吸光度，將所得值代入回歸曲線方程,再按下列公式計算出所稱取的牡荊樣品中總黃酮含量。

式中，X，回歸線方程所得值(mg/mL)；n，稀釋倍數；v，樣液總體積(mL)；V，測定取樣體積(mL)；W，樣品質量(mg)。

1.5 方法學考察

分別從精密度、穩定性、重復性和加樣回收率對1.4已建立的方法進行方法學考察。①精密度試驗：顯色后的供試液連續測6次吸光度，計算總黃酮濃度。②穩定性試驗：供試液分別于顯色0、10、20、30、40、50、60 min測吸光度，計算總黃酮濃度。 ③重復性試驗：制備6份供試液，測定6份供試液的吸光度，計算總黃酮的濃度，重復3次。 ④加樣回收率試驗：平行制備6份供試液，平均分成3組，各取5.0 mL(內含3 mg總黃酮)分別加入一定量的對照品，使加入量分別約為化合物原始含量的80%、100%和120%，測定其吸光度，計算加標回收率。

1.6 單因素試驗

牡荊總黃酮提取的基本條件為：乙醇濃度60%、提取時間1.5 h、提取溫度60 ℃、料液比1∶10。單因素試驗條件：乙醇濃度分別設定為40%、50%、60%、70%、80%和90%；提取時間分別設定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。提取溫度分別設定為40、50、60、70、80和90 ℃；料液比分別設定為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35。分別考察乙醇濃度、提取時間、提取溫度和料液比對牡荊總黃酮提取量的影響。

1.7 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，確定各因素的最優工藝水平，選擇乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、料液比(D)作為考察因素，以牡荊總黃酮的提取量作為考察指標,進行L9(34)正交試驗(表1)。

表1 正交試驗因素水平

1.8 驗證試驗

按照最佳工藝條件下的乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比，進行重復試驗驗證。

1.9 抑菌試驗

復蘇純化后的產氣莢膜梭菌，挑取單菌落接種至FT培養基中，37 ℃厭氧培養5 h至對數生長期。采用滅菌空白培養基校正菌液濃度，使活菌數為1×106CFU/mL，制成菌懸液。

取96孔培養板，在96孔板每孔中加入100 μL FT液體培養基。在第1～7行(A～G)的第1列中，加入牡荊提取液100 μL，按2倍稀釋原則逐級分別稀釋至250、125、62.5、31.25、15.63、7.81和3.91 μg/mL。第1～6行(A～F)中，每孔加入100 μL菌懸液,第7行(G)為陰性對照組，第8行(H)為空白對照組。在37 ℃生化培養箱中厭氧孵育24 h，觀察96孔板中有無菌落生長。考察在最佳工藝條件下提取的牡荊提取物對產氣莢膜梭菌的最小抑菌濃度(MIC)。

2 結 果

2.1 標準曲線

以吸光度為縱坐標、蘆丁標準液的濃度為橫坐標繪制標準曲線(圖1)，回歸方程為：y=11.496x+0.0463，相關系數R2=0.998。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Stand curve of Rutin

2.2 方法學考察

依照方法學考察要求，分別進行精密度、穩定性、重復性及加樣回收率考察。精密度試驗RSD=0.177%，表明該儀器的精密度良好。穩定性試驗在50 min時RSD=2%，說明供試品溶液在50 min內穩定。重復性試驗的RSD=0.94%，符合要求，說明該方法的重復性良好。加樣回收率分別為101.55%、102.56%、104.44%，RSD=1.42%。以上方法學考察結果均符合要求，表明牡荊總黃酮含量測定方法成立。

2.3 單因素試驗

由圖2A可知，隨著乙醇濃度升高牡荊提取液總黃酮含量先升后降，乙醇濃度為60%時總黃酮含量最高(31.10 mg/g)。由圖2B可知，隨著提取溫度升高牡荊提取液中總黃酮含量逐漸降低，提取溫度為40 ℃時，總黃酮含量最高(30.69 mg/g)。 由圖2C可知，隨著提取時間延長牡荊提取液中總黃酮含量先降后升再降，提取時間為2.5 h時總黃酮含量最高(30.69 mg/g)。 由圖2D可知，隨著料液比的增加牡荊提取液總黃酮含量基本呈先升后降趨勢，在料液比為1∶35時，總黃酮含量最高(44.35 mg/g)。

2.4 正交試驗

由表2可知，最佳提取工藝條件組合為：A3B2C3D3，即乙醇濃度60%、提取溫度50 ℃、提取時間2.5 h、料液比為1∶35，由RD>RC>RA>RB得其因素影響順序為：料液比>提取時間>乙醇濃度>提取溫度。

2.5 驗證試驗

按照最佳工藝條件進行重復試驗驗證，在最佳提取工藝條件下3次驗證試驗提取物總黃酮含量分別為46.23、45.28和46.16 mg/g，平均可達45.89 mg/g，RSD為1.15%，具有較好的重復性。

2.6 抑菌試驗

牡荊提取物對產氣莢膜梭菌的MIC檢測結果見表3。由表3可知，牡荊提取物對產氣莢膜梭菌具有較好的抑制效果，MIC值為7.81 μg/mL。

圖2 乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和料液比(D)對牡荊提取液總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration (A),extraction temperature (B),extraction time (C) and solid-liquid ratio (D) on total flavonoids content of V. negundo extract

表2 正交試驗結果

表3 最小抑菌濃度測定結果

3 討 論

黃酮類化合物是植物經光合作用產生的一大類低分子質量的天然物質[11],廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實中,且具有廣譜抑菌性[12]，多種耐抗生素的細菌依然對其敏感，且該類化合物不易產生耐藥性[13]。牡荊屬植物中普遍存在黃酮類化合物,從該屬植物中已獲得的黃酮類化合物有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查耳酮、二氫查耳酮以及黃烷醇種結構類型共49個化合物,其中16個為黃酮苷類[14]。孫阿寧等[15]在牡荊素對葡聚糖硫酸鈉所誘導的小鼠潰瘍性結腸炎的藥效試驗中發現，牡荊素能有效減輕小鼠試驗性潰瘍性結腸炎,緩解炎癥反應。 所以本試驗以總黃酮提取量作為主要考察指標。

黃酮類化合物多為結晶性固體，少數為無定型粉末，不溶于水或難溶于水，易溶于有機溶劑[16]，目前最常用的有甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯[17]等有機溶劑,由于乙醇無毒性、價格低廉,所以本試驗選擇采用乙醇加熱回流對牡荊進行提取工藝的優化。由正交結果及方差分析可知，乙醇加熱回流提取牡荊總黃酮的最優工藝為乙醇濃度60%、提取時間2.5 h、提取溫度50 ℃、料液比為1∶35，其因素影響順序為料液比>提取時間>乙醇濃度>提取溫度。驗證試驗結果表明，在最優提取工藝下，總黃酮提取量平均可達45.89 mg/g。代現平等[18]在山牡荊總黃酮提取工藝試驗中發現，黃酮提取量平均為39.63 mg/g，本試驗的牡荊總黃酮的提取量相對較高。黃瓊[19]在牡荊揮發油和黃酮提取工藝試驗中得出微波法的提取效果最好，微波法有節省提取時間和試劑、污染小的優點,但對設備有一定的要求,而且一次性提取的物料較少,不能進行大規模的提取。同時在微波法下考察不同部位總黃酮提取量中，葉的提取量最高，達93.30 mg/g，莖最低，為31.89 mg/g。本試驗所用牡荊為地上部分，總黃酮提取量相對單獨牡荊葉的提取量較低，但是因為牡荊地上部分產量大，采摘方便，乙醇加熱回流也可以滿足大量提取，所以本試驗的提取方法更適用于實際生產中。本提取工藝不足之處在于乙醇用量相對較多，在實際生產中成本較高。

黃酮類化合物具有廣泛抑菌性[20]，但是從應用的角度來看，MIC值<100 μg/mL的黃酮類化合物才具有一定的價值，MIC值<10 μg/mL的黃酮類化合物會引起人們更大的關注[21]。而產氣莢膜梭菌作為一種多產毒素產生菌，是引起人和動物壞死性腸炎的主要病原體[22]，由其引起的雞壞死性腸炎給全世界的家禽養殖業造成了巨大的經濟損失，已成為家禽養殖中最重要的腸道疫病之一的病原體[23]。 在本試驗中，最優提取工藝下的牡荊提取物對產氣莢膜梭菌的MIC值為7.81 μg/mL。段凱文等[24]在中藥及組方對產氣莢膜梭菌體外抑菌試驗中發現黃連的抗菌活性最強，MIC值為0.98 mg/mL,本試驗中牡荊提取物的抑菌濃度相對更低。蘇皓瑀等[25]在酸化劑及其衍生物與植物精油復合使用的體外抑菌試驗中發現，復合精油對產氣莢膜梭菌的MIC值為312.50 μg/mL，植物精油與單月桂酸甘油酯復合物對產氣莢膜梭菌體外抑菌效果最好，MIC值為4.88 μg/mL。本試驗的抑菌試驗結果優于單獨使用復方精油的試驗結果，但不如酸化劑和植物精油復合物的抑菌試驗結果。相較之下，牡荊提取物對產氣莢膜梭菌的體外抑菌能力可觀，有作為新型獸藥或飼料添加劑進行開發的潛力。

4 結 論

牡荊在乙醇濃度60%、提取時間2.5 h、提取溫度50 ℃、料液比為1∶35的提取工藝條件下總黃酮含量最高，可達45.89 mg/g，該條件下的牡荊提取物對產氣莢膜梭菌的MIC值為7.81 μg/mL，有較好的抑菌效果。