基于UPLC-QTOF-MS的呼吸道合胞病毒感染鼠盲腸內容物代謝組研究

桂紅芽，王姝妹，張曉燕，章孝成，黃升海，何茂章

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染所誘發的下呼吸道疾病是導致嬰幼兒死亡的重要因素之一，目前RSV致病機制尚未闡明，且無商品化疫苗[1-2]。研究[3]表明腸道微生物平衡對肺部健康至關重要，腸道與肺之間的相互聯系，現稱之為“腸-肺軸”。腸道微生物種類和代謝產物的改變與免疫反應、炎癥以及肺部疾病的發展有關[4]。腸道菌群代謝產物可影響肺部穩態，如短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)被證明可通過增加調節性T細胞促進白介素-10產生，抑制組蛋白脫乙酰化和一型干擾素從而緩解上、下呼吸道炎癥[5]。除此之外，菌群產生的其他代謝物產物如組胺、12,13-diHOME可通過影響免疫細胞數量及細胞因子水平促進肺部炎癥。研究[6]表明，RSV感染后血清膽汁酸譜發生改變。孟欣 等[7]通過GC-MS代謝組學分析發現尿液和糞便中乳酸和氨基酸類代謝物在Case組與Ctrl組間差異顯著。不同腸道部位菌群數量和種類具有明顯差異，關于RSV感染后盲腸代謝物組成研究尚少。因此研究RSV感染后盲腸代謝物的變化可為后期靶向調控或治療肺部炎癥性疾病提供靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 DMEM細胞培養基(美國 Gibco 公司)；水合氯醛(上海MACKLIN公司)；色譜級甲醇、乙腈(美國Thermo公司)；2-氯苯丙氨酸(上海Aladdin公司)；甲酸(美國Merck公司)；甲酸銨(美國Sigma公司)。

1.1.2主要儀器 UltiMate 3000高效液相色譜儀、Q Exactive Focus質譜儀(美國Thermo公司)，H1650-W冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)，QL-866混勻儀(鄭州南北儀器有限公司)，KW-100TDV超聲波清洗器(昆山舒美公司)，SCIENTZ-48組織研磨器(寧波新芝公司)。

1.1.3病毒和動物模型構建 RSV-Long株由筆者單位保存。SPF級6～7周齡Balb/c鼠(雌性)購自安徽醫科大學實驗動物中心并飼養在安徽醫科大學基礎醫學院P2動物房。實驗(Case)組小鼠經10%水合氯醛(200 μl/只)腹腔注射麻醉后經鼻滴入50 μl無菌RSV-Long株病毒懸液(n=7)，對照(Ctrl)組小鼠采用同體積的無菌DMEM液滴鼻(n=6)。感染3 d后，腹腔注射水合氯醛深度麻醉Balb/c小鼠。行75%乙醇溶液擦拭腹部，在超凈工作臺對小鼠進行解剖，取下盲腸組織(含內容物)裝入無菌凍存管后放入液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1盲腸內容物代謝物提取 快速稱取100 mg盲腸內容物(±1%)于2 ml EP 管中(置于冰上)，加入提前預冷的 0.6 ml 2-氯苯丙氨酸(0.004 g/L)甲醇(-20 ℃)，渦旋振蕩30 s；此外，向之前的管子中加入 100 mg 玻璃珠，在高通量組織研磨儀中以60 Hz 頻率研磨 90 s；隨即進行室溫超聲 10 min；樣品以12 000 r/min離心10 min(4 ℃)。用0.22 μm膜對300 μl上清液進行過濾并加入到色譜進樣瓶中；QC(quality control，用來校正樣品分析結果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤)樣品為每個樣本各取10 μl 混合而成；剩余待測樣本將根據每6個樣本穿插一個QC樣本的順序進行液相色譜-質譜(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)檢測，進樣體積為3 μl。

1.2.2液相色譜質譜聯用分析

1.2.2.1色譜條件 超高效液相色譜分析采用 Thermo Ultimate 3000系統，色譜柱為 ACQUITY UPLC? HSS T3 1.8 μm(2.1 mm×150 mm)，自動進樣器和色譜柱溫度分別維持在 4 ℃和40 ℃，流速為0.25 ml/min，進樣體積設定為2 μl并進行梯度洗脫，正離子流動相為0.1%甲酸水(C)-0.1%甲酸乙腈(D)；負離子流動相為5 mmol/L甲酸銨水(A)-乙腈(B)。樣品的梯度洗脫程序設定為：0～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98% B/D；12～13.5 min，98% B/D；13.5～14 min，98%～2% B/D；14～20 min，2% D-正模式(14～17 min，2% B-負模式)。

1.2.2.2質譜條件 質譜采集系統使用Thermo Q Exactive Focus，配備電噴霧離子源(ESI)，具有正負離子掃描模式。電噴霧源參數設定如下：毛細管電壓正、負離子條件下分別設定為3.50 kV和2.50 kV；樣本和萃取錐孔電壓分別為40 V和4.0 V。脫溶劑氣流量為800 L/h，溫度為400 ℃，錐孔氣流量為40 L/h，溫度為100 ℃。分辨率為70 000 進行數據全掃描，數據采集范圍為0.08～1 ku，并采用 HCD 進行二級裂解，碰撞電壓為 30 eV，同時采用動態排除去除不必要的質譜二級碎片信息。

1.2.2.3質譜采集數據處理 采用Proteowizard軟件(v3.0.8789)將質譜下機原始數據格式raw轉換為mzXML格式(此為XCMS軟件的輸入文件格式)；基于R軟件(v3.3.2)的XCMS程序包進行如下數據處理：峰識別(peaks identification)、峰過濾(peaks filtration)、峰對齊(peaks alignment);主要參數設定如下：bw=2, ppm=15, peakwidth=c(5, 30), mzwid=0.015, mzdiff=0.01, method=centWave；得到包括質荷比(mass to charge ratio, m/z)、保留時間(retention time, rt)、峰面積(intensity)等信息的三維數據矩陣用于后續生物信息學統計分析。

1.3 統計學處理首先對離子強度數據表進行基于峰面積的批次歸一化處理(batch normalization)。采用SIMCA-P軟件(14.1版本，Umetrics公司)對經過歸一化的數據進行多元統計分析：如主成分分析(principal component analysis, PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)數據分析。單變量統計分析采用R軟件Wilcoxon Mann-Whitney組間差異檢驗。初步篩選符合P<0.05、 OPLS-DA第一主成分變量重要性投影(variable important in the projection，VIP)>1，兩個條件的代謝物用于進一步構建二元邏輯回歸模型，篩選能夠預測RSV感染的代謝物標志物，通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)并計算曲線線下面積(area under the curve，AUC)來表征模型預測的準確性。利用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)網站對鑒定出的差異代謝物進行代謝通路分析。

2 結果

2.1 小鼠盲腸內容物代謝輪廓基于UPLC-QTOF-MS平臺所采集的正、負離子模式基峰色譜(BPC)圖(圖1)，Case組小鼠盲腸內容物圖譜與Ctrl組小鼠有明顯差別。

圖1 Case組模型小鼠和Ctrl組小鼠盲腸內容物代謝組學色譜基峰圖A:正離子模式；B:負離子模式

QC樣本質譜峰變異系數統計見圖2，可以看到離子特征峰相對標準偏差(RSD)<30%的比例能達到80%左右，而且PCA圖顯示QC樣本分布集中，說明數據穩定性和可重復性良好。

圖2 基于代謝物特征峰的主成分分析圖和QC樣本特征峰RSD分布圖A:正離子模式；B:負離子模式

2.2 差異代謝物篩選與鑒定正、負離子模式分別得到33 200、28 405個前體分子。利用OPLS-DA對Case組和Ctrl組盲腸內容物代謝組學特征值進行差異分析，見圖3。正離子和負離子模式下Case組和Ctrl組均顯示明顯的分離。

圖3 正離子(A)和負離子(B)模式下兩組代謝譜OPLS-DA得分圖

RSV小鼠模型建立后盲腸內容物差異代謝物以組間P<0.05、VIP>1為過濾標準，分別在正離子模式和負離子模式下篩選到3 310和2 714個組間差異代謝物特征值。合并正負離子后進行代謝物的定性分析，代謝物的鑒定首先需獲得精確的代謝物分子量(分子量誤差<15 ppm)，再根據代謝物的MS/MS模式所得碎片信息在HMDB數據庫(http://www.hmdb.ca)、 Metlin數據庫(http://metlin.scripps.edu)和massbank(http://www.massbank.jp/)等商業數據庫及自建標準品數據庫中進一步匹配注釋獲得代謝物準確信息。根據注釋結果得到33個有確定名稱的組間差異代謝物生物標志物并通過熱圖進行展示，見圖4。

圖4 經注釋后在模型組和對照組間差異顯著的代謝物熱圖

2.3 隨機森林篩選預測RSV感染的代謝物標志物為進一步解析盲腸內容物代謝物變化與RSV感染的關系，對33個組間差異代謝物進一步構建隨機森林分類模型，篩選能用于準確預測RSV感染的代謝物標志物。隨機森林分類模型鑒定到16個對模型分32類最重要的代謝物，按照“MeanDecreaseAccuracy”參數排序后主要有：鵝去氧膽酸甘氨酸耦合物、還原核黃素、dAMP等。ROC曲線分析結果顯示16個代謝物能以高穩定性和高準確率將Case組和Ctrl組區分開來，其中ROC曲線線下面積AUC值為100%，靈敏度為100%，特異性為100%。見圖5。

圖5 隨機森林分類模型篩選與RSV感染相關代謝物標志物A：采用隨機森林法對代謝物進行平均精確度下降系數排序；B：利用隨機森林模型預測Case組和Ctrl組的受試者操作特征曲線

2.4 代謝通路分析將隨機森林分析鑒定到的16個代謝物上傳到Metaboanalyst網站進行通路分析。KEGG數據庫以編碼代謝物的基因和基因組的功能信息為基礎，以代謝反應為線索，將可能的代謝途徑及對應的調控蛋白進行串聯，以圖形化的方式展示細胞生理生化過程。代謝物的富集分析結果顯示(圖6)，Case組和Ctrl組盲腸內容物的差異代謝物主要富集到賴氨酸分解、半胱氨酸和蛋氨酸代謝和丙酸鹽代謝通路。

圖6 差異代謝物代謝組通路氣泡圖

3 討論

機體微生物組對宿主免疫至關重要，RSV感染刺激機體抗病毒免疫會導致腸道菌群紊亂。呼吸道病毒與腸道菌群關系密切，病毒感染誘導腸道菌群失調后，改變了固有細菌代謝能力，此種情況下腸腔內代謝產物的數量和種類與正常穩態情況下差異巨大。盲腸菌群是發酵宿主難消化膳食纖維的主要場所，產生大量的短鏈脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸，短鏈脂肪酸可發揮局部和系統影響。研究[8]表明短鏈脂肪酸可以通過激活G-蛋白偶聯受體發揮調控免疫細胞的激活和功能，此外還可以抑制組蛋白去乙?；富钚?，維持腸道穩態。已有研究[9]顯示孕婦攝入足量的水果和蔬菜(膳食纖維來源用于產生短鏈脂肪酸)可保護后代抵御RSV感染。有研究[10]證明給小鼠補充高膳食纖維飲食可通過降低病毒載量和炎癥抵御RSV疾病，該保護方式依賴于腸道菌群及其產生的短鏈脂肪酸，其中小鼠和細胞實驗表明，乙酸可誘導肺部的β干擾素(interferon , IFN-β)生成、促進Ⅰ型IFN應答，IFN-Ⅰ受體介導了乙酸對RSV感染的抵抗作用，該作用還依賴于G蛋白偶聯受體Gpr43和核因子κB(NF-κB)的活化。

本研究中PCA和OPLS-DA均顯示Case組和Ctrl組小鼠的盲腸內容物樣本能夠完全分離，說明兩組盲腸內容物代謝譜有明顯差異，提示小鼠感染RSV后盲腸內容物代謝發生紊亂。結果顯示，Case組小鼠盲腸顯著富集L-絲氨酸、油酸等代謝物和脂質分子。Yan et al[11]采用人冠狀病毒229E(HCoV-229E)為模型冠狀病毒研究冠狀病毒感染后宿主細胞脂質的變化，發現24種脂類包括油酸、亞油酸和花生四烯酸等在細胞感染后顯著上調。病毒復制需要特定的細胞脂質成分，任何脂質組分的破壞都可能降低病毒復制的效率。甘氨酸鵝去氧膽酸在Case組顯著富集，而且隨機森林模型鑒定出甘氨酸鵝去氧膽酸是預測RSV感染最重要的代謝物標志物(圖5A)，甘氨酸鵝去氧膽酸去耦合作用需要腸道菌群的參與以及RSV感染后甘氨酸鵝去氧膽酸的升高說明膽汁酸的正?！案文c循環”發生失調[12]。上述結果初步說明RSV感染會影響盲腸膽汁酸代謝發生改變。研究表明甲硫氨酸是抗氧化物質谷胱甘肽和牛磺酸的前體物質[13], 谷胱甘肽可以通過清除羥自由基及超氧化物來保護機體[14], 所以盲腸中甲硫氨酸含量的降低可能是RSV病毒通過“肺-腸軸”誘發腸道損傷及菌群代謝的潛在原因之一。本研究顯示，隨機森林分析篩選出16種可將RSV和正常鼠區分的差異代謝物，說明它們可能是潛在的代謝物標志物。代謝物標志物的篩選可為RSV的診斷和開發靶向RSV感染的小分子藥物研究提供線索。