三種滇黃精資源多糖及代謝相關酶活性的關系

張 磊，李彥瑩，朱新焰，王家金，徐 哲，錢華麗，季鵬章,

(1. 云南中醫藥大學中藥學院/云南省南藥可持續利用研究重點實驗室，昆明 650500；2. 云南省農業科學院藥用植物研究所，昆明 650203)

【研究意義】中藥黃精基源之一的滇黃精(PolygonatumkingianumColl. et Hemsl.)是云南道地藥材，分布于云南、四川、貴州、廣西等省(區)，常見于海拔620～3650 m的陰濕林地、水溝邊和灌木叢。多糖作為滇黃精品質的指標性成分，2020版《中國藥典》規定，在黃精藥材中含量不得少于7%[1]。黃精多糖作為主要活性成分，對人體具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎抗菌、調節血糖血脂、抗病毒、增強免疫力及改善記憶力等作用[2-5]，由葡萄糖、單一果糖、半乳糖等構成[6-11]。蔗糖是光合產物的主要運輸形式，為代謝提供呼吸底物。蔗糖合成酶(Sucrose synthetase, SS)和磷酸蔗糖合成酶(Sucrose phosphate synthase, SPS)在糖代謝過程中將蔗糖轉化為尿苷二磷酸葡萄糖(Uridine diphosphate glucose, UDPG)和果糖，蔗糖轉化酶將蔗糖轉化為果糖和葡萄糖，它們對糖代謝過程有著重要作用[12]。【前人研究進展】研究發現鐵皮石斛、枸杞的多糖含量與SPS、SS、酸性轉化酶(Acid invertase, AI)和中性轉化酶(Neutral invertase, NI)有顯著的相關性[13-15]；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(Uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase, UGPase)是微生物多糖合成關鍵酶，幾種藥用植物分析表明UGPase等酶與多糖的合成有較強的相關性，如黃芪、靈芝多糖含量與UGPase、α-磷酸葡萄糖變位酶(α-glucophosphatase, α-PGM)和磷酸葡萄糖異構酶(Phosphoglucose isomerase, PGI)相關[16-17]。【本研究切入點】黃精多糖是黃精的主要有效成分，研究滇黃精種質資源多糖變化規律，對滇黃精良種選育、質量控制、道地藥材品質挖掘有著重要意義。【擬解決的關鍵問題】以滇黃精種質資源為研究對象，篩選多糖差異顯著的滇黃精資源進行多糖含量變化及其糖代謝相關酶活性的關系研究，旨在揭示差異種質滇黃精多糖變化及其糖代謝相關酶活性的關系，發掘不同種質滇黃精多糖合成差異的關鍵酶。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

13份滇黃精種質資源，為多年生野生植株，分別采集于滇黃精的主要產區：云南省昆明市、文山州、大理州、德宏州、普洱市、臨滄市等地(表1)，經云南中醫藥大學徐福榮研究員鑒定為百合科植物滇黃精(Polygonatumkingianum)。上述資源種植于云南中醫藥大學滇源基地。按照滇黃精規范化栽培技術統一種植管理，于2019年11月采集，備用。

表1 滇黃精資源信息

1.2 滇黃精種質資源多糖含量及組分測定

1.2.1 多糖含量的紫外分光光度計測定 (1)溶液前處理。參照2020版藥典[1]中對黃精多糖含量測定進行優化：取新鮮滇黃精塊莖切塊，于45 ℃烘干，打粉過50目篩，精確稱取0.2 g放200 mL燒杯中，加80%乙醇150 mL，用塑料膜封口，沸水浴1 h，趁熱過濾，用80%熱乙醇洗滌濾渣3次，將洗滌過的濾渣和濾紙放入干凈燒杯中，加水150 mL，用塑料膜封口，沸水浴1 h，趁熱過濾，將洗液和濾液合并倒入200 mL容量瓶中定容，備用。

(2)對照品溶液制備。取無水葡萄糖對照品33 mg，加水定容至100 mL。

(3)標準曲線制備。取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置25 mL具塞試管中，加水至2 mL，混勻，放置冰水浴中緩慢加入0.2%蒽酮—硫酸溶液至10 mL，搖勻，放冷后沸水浴10 min，立即取出冰水浴10 min，在582 nm處對吸光度進行測定。將濃度作為橫坐標(x)、吸光度作為縱坐標(y)繪制標準曲線。

(4)多糖測定。取供試液1 mL，平行重復3次，置25 mL具塞試管中，參照(3)標準曲線制備的方法，從“加水至2 mL”進行測定，根據標準曲線計算滇黃精多糖含量。

1.2.2 多糖含量的HPLC測定 參照秦垂新等[18]適當調整。

(1)對照品溶液的制備。取對照品加水配制成單糖混合對照品溶液(各單糖濃度為10 g/L)。取混合對照品溶液500 μL加入5 mL的安瓶中，加入0.2 mol/L氫氧化鈉溶液500 μL搖勻，加入0.5 mol/L PMP 500 μL，70 ℃反應60 min。取出，自然冷卻，加入0.2 mol/L鹽酸溶液500 μL混勻，轉移至5 mL離心管中。加入三氯甲烷2 mL混勻，3000 r/min離心10 min，棄三氯甲烷層，多次重復直至三氯甲烷層無色，水層為對照品溶液。

(2)供試品多糖溶液的制備。將本品50～60 ℃減壓干燥，粉碎，過20目篩，稱取粉末2.5 g，加入80%乙醇100 mL，超聲提取1 h，濾過，用80%乙醇將濾器與濾渣洗滌3次，每次10 mL，將濾紙連同濾渣置于燒瓶中，加水100 mL，回流提取1 h，取出，趁熱抽濾，用熱水將燒瓶與殘渣洗滌4次，每次10 mL，將濾液與洗液合并，濃縮至10 mL，自然冷卻，5000 r/min離心20 min，取上清液轉移至10 mL量瓶中，加水定容，搖勻。加入無水乙醇40 mL，慢加快攪，置5～10 ℃冰箱中放置12 h， 5000 r/min離心10 min，棄上清液，用80%乙醇將沉淀洗滌2次，每次10 mL，5000 r/min離心10 min，再用無水乙醇洗滌2次，每次10 mL，5000 r/min離心10 min，棄上清液，加熱水溶解沉淀，轉移至5 mL量瓶中，自然冷卻后加水定容，搖勻，得粗多糖溶液。

(3)多糖溶液的三氟乙酸(Trifluoroacetic acid, TFA)部分酸水解方法。取粗多糖溶液500 μL，置于5 mL安瓶中，加入0.4 mol/L TFA溶液500 μL，封口后置110 ℃水解7 h，取出，自然冷卻，水浴蒸干，殘渣加入甲醇1 mL攪拌，蒸干以去除TFA，重復多次，加熱水溶解沉淀，轉移至1 mL量瓶中，自然冷卻，加水定容，搖勻，得粗多糖水解溶液。

(4)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)衍生化方法。吸取(3)項中粗多糖水解溶液500 μL，置于5 mL安瓶中，加入0.2 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL混勻，加入0.5 mol/L PMP 500 μL，在70 ℃下衍生反應60 min。取出，自然冷卻，加入0.2 mol/L鹽酸溶液500 μL，轉移至5 mL離心管中，加水至1 mL混勻。加入三氯甲烷1 mL，混勻，3000 r/min離心10 min，棄三氯甲烷層，多次重復直至三氯甲烷層無色，水層為供試品溶液。

(5)色譜條件。HPLC: Agilent 1260。色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 流動相0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.8)-乙腈(85∶15)檢測波長250 mm, 柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min。

1.3 代謝酶活性測定

1.3.1 AI、NI、SS、SPS酶活性測定 參照陳梓云[13]的方法適當調整。SS、SPS提取:稱取滇黃精樣品0.7 g于研缽中，液氮快速研磨成粉末，轉移至另一研缽，加入3 mL提取劑迅速研磨均勻，再以4 mL提取劑清洗研缽，將洗液一并倒入離心管中，2 ℃離心10 min(12 000 r/min)，取上清液進行酶活測定；NI、AI提取:取滇黃精樣品0.7 g，液氮研磨成粉末，迅速轉入另一研缽，加入3 mL提取劑，快速研磨均勻，另取4 mL提取劑沖洗研缽，將洗液一并轉入離心管，3 ℃離心10 min(12 000 r/min)，取上清液進行測定。

1.3.2 UGPase酶活性測定 酶提取：取滇黃精新鮮植株塊莖1 g，液氮研磨成粉末，迅速轉入另一研缽，加入提取劑6 mL，快速研磨均勻，另取提取劑4 mL沖洗研缽，將洗液一并轉入離心管，3 ℃離心20 min(3000 r/min)，取上清液進行測定。提取劑包括0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)，2.5 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L DTT，2.5% PVPP。測定：采用酶聯免疫法和酶標儀測定。

1.4 數據分析

采用軟件GraphPad Prism 7進行作圖，使用軟件SPSS Statistics 19.0進行差異顯著性檢驗和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 滇黃精種質資源的多糖含量分析

不同產地的滇黃精資源多糖含量存在顯著差異。東川H1、東川H2、馬關H4、文山H5、永平H6、文山H7、臨翔H8、廣南H9、廣南H10、廣南H11、廣南H12、梁河H13、思茅H14的多糖含量分別為7.63%、10.50%、15.23%、12.01%、11.27%、19.15%、16.45%、22.02%、9.87%、19.22%、29.36%、13.69%、10.2%(圖1)。廣南H12多糖含量最高(29.36%)，東川H1多糖含量最低(7.63%)，廣南H12多糖含量是東川H1的4倍，兩份種質多糖含量存在極顯著差異。據此，選擇H1代表低含量多糖種質、H9代表中含量多糖種質、H12代表高含量多糖種質進行多糖組分及其相關酶活性的分析。

不同字母表示具有顯著性差異(大寫字母：P<0.01；小寫字母：P<0.05)。下同

2.2 H1、H9和H12糖分含量變化特征

滇黃精糖分主要有果糖、蔗糖和葡萄糖等。H1、H9和H12的果糖含量分別為1.18%、6.00%和8.20%；蔗糖含量分別為10.12%、18.33%和25.42%；葡萄糖含量分別為0.25%、0.63%和0.68%。H1、H9和H12種質的蔗糖、果糖和葡萄糖含量均存在顯著差異，并隨多糖含量增加而增加(圖2)。

圖2 不同種質滇黃精種質多糖組分及含量分析

2.3 H1、H9和H12代謝酶活性及特征

H1、H9和H12種質5種酶活性由高到低順序為NI>AI>SPS>SS>UGPase，其中NI活性最高，UGPase活性最低；NI酶活性為606.67～623.33 mg/(g·h)；AI酶活性為473.33～506.67 mg/(g·h)；SPS酶活性為36.00～99.60 mg/(g·h)；SS酶活性為3.59～30.07 mg/(g·h)；UGPase酶活性為20.75 ～ 23.07 μg/(g·h)。H1、H9和H12多糖含量分別為7.63%、22.02%和29.36%。5種酶活性變化與多糖含量變化均呈由低到高的趨勢(表2，圖3)。

5種酶活性H1為最低，H12為最高。H1、H9和H12中SPS、SS的變化差異最大，SPS活性最高和最低值相差近3倍，SS活性最高和最低值相差近9倍；H1、H9和H12中AI、NI活性變化小，AI活性最高值與最低值僅相差33.34活性單位，且H9和H12基本一致；H1、H9和H12種質間UGPase活性呈平緩遞增(表2、圖3)。

表2 不同種質滇黃精蔗糖相關代謝酶活性

圖3 不同滇黃精種質5種酶活性分析

2.4 多糖與代謝酶活性相關性分析

對H1、H9和H12進行多糖組分及其相關代謝酶活性相關性分析，由表3可知，滇黃精種質中，蔗糖含量與UGPase活性呈極顯著正相關，相關系數為1.000；蔗糖與NI的活性呈顯著正相關，相關系數為0.999；蔗糖與其他酶活性無顯著相關性；NI活性與UGPase活性呈顯著正相關，相關系數為0.999；果糖、葡萄糖與SPS、SS、AI、NI呈正相關，但不顯著。

表3 多糖組分與多糖代謝酶活性相關性分析

3 討 論

云南是滇黃精的主要分布中心，種質資源非常豐富。滇黃精藥用部位為根莖，滇黃精根狀莖近圓柱形或近連珠狀、結節有時作不規則菱狀，肥厚、直徑1～5 cm，新鮮根莖富含水分。王彩步等[19]發現云南不同滇黃精資源多糖含量存在差異，在6.70%～14.28%；通過研究，13份種質多糖含量為7.63%～29.36%，差異也明顯。進一步分析，滇黃精H1、H9和H12塊莖蔗糖含量均高于果糖、葡萄糖，其中葡萄糖含量最低、蔗糖含量差異最大，表明蔗糖代謝是滇黃精多糖代謝的主要代謝途徑之一。酶活性分析：不同種質的5種酶活性差異明顯，表明不同種質的多糖積累會有差異，可能與其遺傳基因和酶活性表達差異有關；通過不同種質多糖含量和相關酶活性的相關性分析發現，滇黃精塊莖中蔗糖含量與UGPase、NI酶活性呈極顯著正相關。

UGPase是植物中糖代謝的主要酶類之一，催化尿苷三磷酸和一磷酸葡萄糖可逆反應形成尿苷二磷酸—葡萄糖和焦磷酸，其中尿苷二磷酸—葡萄糖是高等植物中糖合成途徑中關鍵成分，是多糖類合成的葡萄糖基供體[20]。Spychalla等[21]發現，UGPase多集中在根莖等非光合作用的貯藏組織中。吳曉俊等[22]認為，UGPase在植物的非光合作用組織, 尤其是儲藏組織中的含量較高。吳曉俊等[16]通過分析黃芪毛狀根中UGPase活性與多糖含量的關系，發現UGPase是黃芪多糖合成的關鍵酶；蔗糖轉化酶不可逆催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖，是蔗糖代謝關鍵酶之一[12]。Bachelier等[23]認為，位于細胞壁中的蔗糖轉化酶能調節蔗糖從韌皮部卸出從而控制吸收累積，而位于液泡中的轉化酶可以調節蔗糖和己糖的貯存。在甜瓜快速膨大的幼嫩組織中，轉化酶活性非常高[24]。可溶性NI為碗豆的生長提供足夠的己糖[25]，NI在草莓果實發育的中期階段最高，而后下降，但成熟時活性大于AI[26]。趙建華等[14]對不同果色枸杞果實糖含量和蔗糖代謝酶活性分析，發現紅色與黑色枸杞己糖含量與NI呈顯著相關。

通過研究驗證了上述結果，滇黃精的塊莖中UGPase活性較高，其多糖含量和UGPase活性呈正相關；滇黃精塊莖中NI活性較高，其多糖含量和NI活性呈正相關。表明不同種質滇黃精中蔗糖的積累、形成與UGPase、NI這兩種酶的活性密切相關，NI活性和UGPase活性的提高有利于滇黃精中蔗糖的積累。通過研究初步闡明了不同種質滇黃精多糖含量及其相關代謝酶的特征和變化關系，但相關分子機理仍不清楚，需要開展轉錄組、代謝組等分子機理研究，探明不同種質滇黃精多糖積累的分子機制。

4 結 論

以滇黃精種質資源為對象，對多糖差異顯著的滇黃精種質的多糖含量變化及其糖代謝相關酶活性的相關性進行研究，發現不同產地的滇黃精資源多糖含量差異明顯；蔗糖、果糖和葡萄糖含量隨滇黃精多糖含量的增加而增加；5種酶活性由高到低順序為NI>AI>SPS>SS>UGPase，且酶活性隨多糖含量升高而升高；UGPase、NI與滇黃精蔗糖積累呈顯著的正相關(P<0.05)。推測NI、UGPase是不同種質滇黃精多糖合成的關鍵酶。研究結果可為滇黃精良種選育、質量控制、道地藥材品質挖掘提供參考。