金銀花快繁體系構建及其總黃酮含量的測定

何明揚，楊 洋，陳智勇

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

金銀花又名忍冬（Lonicera Japonica），其根、莖、葉、花、果實均可入藥，自古被譽為清熱解毒的良藥，用于治療身熱、發疹、發斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等熱病[1]。忍冬屬植物還在綠化觀賞、營養保健、日用化工、保持水土及畜牧獸醫等領域具有重要的經濟價值[2-3]。

金銀花中含有黃酮等多種化合物[4]，是藥用植物資源中含天然黃酮類化合物最多的植物之一[5]。黃酮類化合物具有抗老化、抗突變、調血脂、降血壓等功能，是一類具有極大開發前景的天然有機抗氧化劑[6]。黃酮還可以抑制炎性生物酶的滲出，促進傷口愈合并止痛[7]。金銀花莖葉與花的藥性相同，近年來利用金銀花莖葉提取黃酮的研究也慢慢增多[8]。筆者通過測定金銀花愈傷組織和再生植株莖葉中的總黃酮含量，并與其外植體野生型金銀花莖葉總黃酮含量進行對比，得到金銀花組織快速繁殖階段中不同材料總黃酮含量的變化。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 金銀花品種 參試金銀花品種為長沙金銀花野生種，采自瀏陽大圍山地區。取金銀花幼葉進行愈傷組織誘導，取金銀花快繁過程中外植體莖葉、愈傷組織及再生植株莖葉進行總黃酮的測定。

1.1.2 主要儀器設備 電子天平、紫外可見分光光度計、烘干機、粉碎機、恒溫水浴鍋、超聲波清洗器等。

1.1.3 主要試劑 80%乙醇溶液、5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液等。

1.1.4 基本培養基 MS 培養基[9]，蔗糖3%，瓊脂0.7%，pH 值5.8（滅菌前），高壓蒸汽滅菌（121℃，101 kPa，20 min）。其中生根培養基使用1/2MS 培養基并通過分別添加NAA（萘乙酸）、6-BA（6-芐基腺嘌呤）、2,4-D（2, 4-二氯苯氧乙酸）等不同植物激素來調控植物生長[10-13]。

1.1.5 培養條件 培養溫度為25℃，光照2 500 Lx，每天照射12 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 金銀花愈傷組織的誘導 取金銀花的幼葉浸泡在吐溫80 中2 min 后用自來水反復沖洗干凈。然后放置于滅過菌的三角瓶中，用75%的酒精浸泡15 s，用0.1% HgCl2浸泡8 min，再用無菌水反復沖洗3～4 次，用滅菌過的解剖刀將葉片切成0.5～1.0 cm2大小的外植體接種于編號1～5 號，2,4-D 含量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L 的MS 培養基上。每瓶3 個外植體，每個處理接種10 瓶，15 d 后統計愈傷組織誘導率。

1.2.2 不定芽的誘導 在超凈無菌工作臺中，取生長良好且長勢一致的愈傷組織放無菌紙上，用滅過菌的解剖刀將其切割成適當大小后接種至編號1～16 號，6-BA（mg/L）和NAA（mg/L）激素配比分別為0.5 ∶0.01、0.5 ∶0.05、0.5 ∶0.10、0.5 ∶0.50、1.0 ∶0.01、1.0 ∶0.05、1.0 ∶0.10、1.0 ∶0.50、1.5 ∶0.01、1.5 ∶0.05、1.5 ∶0.10、1.5 ∶0.50、2.0 ∶0.01、2.0 ∶0.05、2.0 ∶0.10、2.0 ∶0.50的MS 標準培養基上。每瓶接種3 塊愈傷組織，每個處理接種10 瓶。20 d 后觀察并統計不定芽的誘導和分化情況，約30 d 繼代一次。

1.2.3 不定芽的擴繁 取生長良好且長勢一致的不定芽，切割成大小和數目都相同的不定芽叢（下端帶有愈傷組織）后接種至編號1～9 號，6-BA（mg/L）和NAA（mg/L）激素配比分別為1.0 ∶0.01、1.0 ∶0.05、1.0 ∶0.10、1.5 ∶0.01、1.5 ∶0.05、1.5 ∶0.10、2.0 ∶0.01、2.0 ∶0.05、2.0 ∶0.10 的MS 標準培養基上。每瓶接種3個，20 d 后觀察并統計不定芽的擴繁和生長情況，約30 d 繼代一次。

1.2.4 生根培養及煉苗移栽 在超凈無菌工作臺中，將生長至3～5 cm 的不定芽自基部切下，接種至編號1～7 號，NAA 含量分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L 的1/2MS 標準培養基上，每瓶3 株。每個處理接種10 瓶，20 d 后觀察并統計生根的情況，30 d 繼代一次。在不定芽生根培養基培養30 d并長出根以后，將培養瓶轉移到煉苗室中培養2 d，然后移栽到營養土（泥炭土 ∶ 珍珠巖=3 ∶1）中，25℃下培養，定期澆水，20 d 后觀察并統計幼苗成活率。

1.2.5 總黃酮含量測定 根據王晉[14]的方法，通過蘆丁標準液在510 nm 處測得的吸光度（Y）對濃度（X）進行回歸，得到回歸方程Y=1.2614X-0.0261，以此進行總黃酮含量測定。對照組為試劑空白溶液，在510 nm 波長下讀取吸光值A?？傸S酮含量計算公式如下。

W=[（Y+0.026 1）×50/（1.261 4×M）]×100%

公式中，Y表示吸光度；M表示金銀花樣品重量（mg）；W表示金銀花中總黃酮含量；50 為稀釋倍數。

1.3 數據處理

試驗數據采用Exsel 軟件統計分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度2, 4-D 對金銀花愈傷組織誘導的影響

從表1 中可以看出，金銀花外植體在不同2,4-D濃度下誘導愈傷的生長狀況和誘導率均有較明顯的差別。在低于3.0 mg/L 濃度時愈傷組織顏色偏黃，而在4.0 mg/L 及以上濃度誘導的愈傷組織顏色較綠，濃度在3.0～4.0 mg/L 時愈傷誘導率較高，生長狀況好。其中，當濃度為4.0 mg/L 時愈傷誘導率最高，且顏色較綠，為金銀花誘導愈傷組織的最佳濃度。

表1 不同濃度2,4-D 處理金銀花外植體愈傷組織的誘導情況

2.2 不同激素配比對金銀花不定芽誘導的影響

從表2 中可得，隨著6-BA 濃度的升高，不定芽的誘導率先上升再下降；隨著NAA 濃度的升高，不定芽的誘導率有所下降。

表2 不同6-BA 和NAA 含量配比處理金銀花不定芽的誘導情況

試驗顯示6 號和7 號培養基配方的不定芽誘導率較高，且不定芽粗壯高大，顏色較綠，尤其是7 號，故6-BA 1.0 mg/L 及NAA 0.10 mg/L 為較理想的不定芽誘導激素配比。

2.3 不同激素配比對金銀花不定芽增殖的影響

從表3 可以看出，隨著6-BA 濃度的逐漸升高，誘導擴繁率整體呈現上升趨勢，當6-BA 濃度為1.5 mg/L 時，不定芽增殖效率達到最大，之后出現下降趨勢。隨著NAA 濃度的緩慢升高，不定芽的增殖效率先是呈上升趨勢，當NAA 濃度超過0.05 mg/L 后，不定芽增殖率明顯下降。

由研究結果可知，1 號、4 號、5 號和8 號培養基的不定芽增殖率較高，都達到60%以上。其中5號培養基的平均增殖率最高，達到79.33%，且不定芽粗壯高大。因此，較理想的不定芽增殖激素配比為6-BA 1.5 mg/L 和NAA 0.05 mg/L。

2.4 不同濃度NAA 對金銀花不定芽生根的影響

從表4 中可得，隨著NAA 濃度的逐漸升高，不定芽的生根率逐漸升高，且隨著NAA 濃度的升高，根生長變粗壯。但當NAA 濃度超過2.0 mg/L 后，生根率下降。因此，1/2MS+NAA 2.0 mg/L 為最適不定芽生根培養基。

表4 不同濃度NAA 處理金銀花不定芽的生根及成活情況

2.5 不同材料總黃酮含量的測定

通過紫外分光光度計法，測得非組培外植體莖葉、愈傷組織和再生植株莖葉提取液的總黃酮含量分別為2.456%、2.642%和1.81%，愈傷組織中的黃酮含量最高，外植體莖葉中黃酮的含量次之，再生植株中黃酮的含量最低，且與二者的差異顯著。

3 討 論

3.1 外植體的選擇和處理

不同種植物及同一植物不同器官對愈傷組織誘導的條件是不相同的。試驗中選用幼嫩的葉片為最適合的外植體。對于外植體的滅菌，用吐溫80 進行預處理，可以增加消毒劑對葉片的滲透作用。結合75% 乙醇和0.01% HgCl2處理，可以達到最佳的滅菌效果[15]。

3.2 培養基的選擇以及激素的配比

試驗以MS 為基本培養基[16]，在以6-BA 和NAA 為激素進行濃度組合誘導不定芽的試驗中，細胞分裂素6-BA 濃度在1.0 mg/L 左右時可以很好促進金銀花不定芽的增殖，超過2.0 mg/L 后，濃度越高，植株生長越差。NAA 是植物生長素，當培養基中加入約0.10 mg/L 的NAA 時，金銀花不定芽增殖效果最好，長勢良好，但當濃度大于0.10 mg/L 后，濃度越高，側芽增殖越慢，并且隨著試驗時間的延長，極易出現褐化現象，并最終枯萎死亡。

3.3 生根誘導及再生植株移栽

多項資料顯示，金銀花的生根比較容易，加入適量濃度的NAA 后，極易長出不定根，但濃度不宜太大，此試驗以1/2MS+NAA 2.0 mg/L 為理想的生根培養基配方。同時，糖的濃度對根誘導影響較大，濃度過低時，生長緩慢；濃度過高時，又有大量誘導愈傷組織形成，不利于根的形成[17]，所以此試驗采用1.5%的蔗糖。

將生根的再生植株移栽種植，影響移栽成活率的主要原因是不定芽與根之間長出了愈傷組織，即莖的維管組織和根的維管組織中間有無定形愈傷組織，造成莖和根的維管組織不能正常連接，根吸收的水分和養料不能送到地上部分的枝葉，葉片光合作用生成的有機物也不能運送給根，從而造成植物枯萎，最終死亡。

3.4 金銀花總黃酮含量的測定

金銀花花期為4—6 月，雖然金銀花花中的總黃酮含量比莖葉中的稍多，但是金銀花一年才開花1 次，花期短，因此從金銀花莖葉中提取黃酮化合物不失為一個持續獲取黃酮的方法。紫外可見分光光度計法檢測表明，愈傷組織中的總黃酮含量最高，其次是外植體莖葉，再生植株莖葉中含量最低。由此可見，通過愈傷組織的大量增殖和大型培養罐等收集代謝次生物，可以很大程度提高金銀花黃酮類化合物的生物產量。鑒于此結果，可以將金銀花快速繁殖和天然黃酮化合物提取結合起來，利用金銀花離體培養來獲得大量的愈傷組織，再從中提取所需天然黃酮。