HPCE法測定沅江酸橙果實中辛弗林的含量

呂小剛，劉 旭，陳 靜，陳建華，梁引庫，欒明寶

（1. 陜西理工大學，生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2. 中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

酸橙（Citrus aurantiumL.）為蕓香科柑橘屬植物，是中醫臨床常用的理氣藥，枳實、枳殼分別為酸橙的干燥幼果和未成熟果實，是其入藥部位，主產于四川、重慶、湖南、江西、福建等省。枳實為5—6 月收集的自落果實，枳殼為7 月果實尚綠采收的果皮。枳實、枳殼的活性成分基本一致，主要為黃酮類、生物堿類和揮發油類等，因采收期不同，其質量分數有所差異而分開入藥[1-3]。枳實的主要特征成分為生物堿辛弗林，是衡量酸橙品質的重要指標之一[4]，具有增加熱量消耗、氧化脂肪、升壓強心等藥理作用[5]，被廣泛應用于食品、醫藥、飲料等保健品行業[6]。

目前，酸橙中辛弗林的定量分析主要以反相高效液相色譜（RP-HPLC）為主，為了延長堿性較強的小分子化合物辛弗林在常規色譜柱上的保留時間，通常會添加有害離子以便試劑不被快速洗脫，但此操作會減少色譜柱的使用壽命，且復雜成分的梯度洗脫增加了分析時間[7-8]。而高效毛細管電泳（HPCE）具有樣品前處理簡單、無需預富集、樣品和溶劑用量少、分析耗費低、速度快、分離度高等優點，相比于RPHPLC 更加適用于成分復雜的天然產物的測定[9]。

沅江市為湖南省酸橙傳統主產區，產量長期處于全國首位[10]。由于采收期對酸橙藥材質量有重要影響[11]，故采用HPCE 法測定沅江酸橙從幼果到未成熟果實的整個生長周期的生物堿辛弗林含量動態變化，以期為沅江市酸橙最佳采收期的確定、質量評價與控制等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酸橙樣品采集于湖南益森沅江枳殼中藥研究所資源圃，選取21 株酸橙種質，每株從不同方位采摘酸橙果實作為試驗樣品，酸橙的花期為4—5 月，5 月掛果，11 月果熟，從2020 年5 月18 日—9 月5 日，每隔半個月采集1 批，共采集8 批酸橙樣品。試驗前樣品需要進行前處理，將酸橙果實切片，曬干或低溫干燥，粉碎機粉碎，備用。

主要試劑：氫氧化鈉、四硼酸鈉（分析純，湖南匯虹試劑有限公司），磷酸二氫鉀（分析純，廣東光華科技股份有限公司），甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），甲醇（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），辛弗林標準品（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）。

主要試驗儀器：Agilent 7100 型高效毛細管電泳儀（配置DAD 檢測器、Agilent OpenLAB C.01 工作站），XMTD-7000 水浴鍋，AX124ZH/E 電子天平。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線繪制 精密稱取辛弗林標準品0.010 6 g，加入甲醇溶解并定容于10 mL 容量瓶，配制成1.06 mg/mL 辛弗林標準品溶液。取辛弗林標準品溶液，在甲醇溶液中連續稀釋成不同濃度梯度，以標準品溶液的濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

1.2.2 酸橙樣品溶液制備 精密稱取酸橙樣品粉末1.000 g，加入30 mL 無水甲醇，稱定重量，在70℃水浴中加熱回流提取2 h，放冷，再次稱定重量，用甲醇補足減失的重量，將提取液以3 000 r/min 離心10 min，取上清液過0.45 μm 濾膜，取濾液作為樣品溶液，上機檢測。

1.2.3 電泳條件優化 （1）檢測波長：取辛弗林標準品溶液，通過DAD 二極管陣列檢測器全波長（190～400 nm）掃描，得到最優檢測波長。（2）緩沖液：比較酸橙樣品在相同濃度的四硼酸鈉緩沖液、四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩沖液和四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩沖液-30%甲醇緩沖液中目標物色譜峰的峰形和分離效果，再進一步考察不同濃度（20、30、40、50、60 mmol/L）四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩沖體系對樣品目標物峰形的影響。（3）分離電壓：試驗分別考察10、15、20、25、30 kV 分離電壓對酸橙樣品辛弗林峰形和分離效果的影響。

1.2.4 方法學考察 （1）精密度試驗：取1.2.1 中標準品溶液，連續進樣5 次，測定辛弗林峰面積，考察檢測方法的精密度。（2）重復性試驗：精密稱取50號酸橙種質樣品粉末1 g 共6 份，按1.2.2 制備樣品溶液，測定辛弗林峰面積，考察檢測方法的重復性。（3）穩定性試驗：取酸橙樣品溶液，在室溫下儲存，分別在0、1、2、4、6、8 h 進樣測定其含量，考察檢測方法的穩定性。（4）加標回收率試驗：精密稱取已知辛弗林含量的同批酸橙樣品5 份，每份0.5 g，精密加入15 mL 辛弗林標準品溶液，按1.2.2 樣品溶液制備方法處理后進行檢測，考察檢測方法的回收率。

2 結果與分析

2.1 電泳條件優化結果

2.1.1 檢測波長的選擇 通過DAD 二極管陣列檢測器全波長（190～400 nm）掃描，紫外光譜圖見圖1，在223 nm 處，標準品辛弗林有最大吸收峰，且基線平穩，無背景干擾，因此選取223 nm 作為檢測波長。

圖1 辛弗林標準品溶液紫外光譜圖

2.1.2 緩沖液體系和濃度的選擇 如圖2 所示，磷酸二氫鉀試劑的加入可明顯改善辛弗林色譜峰峰形，峰形更加對稱、尖銳，峰高也有所增大，有機改性劑可以提高選擇性，增大分離度，改善峰形。因此，綜合選取四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩-甲醇緩沖體系進行后續試驗。由圖3 可知，緩沖液濃度較低時，樣品目標峰出峰時間短，但峰形較寬，分離度低，且有其他雜峰干擾；隨著緩沖液濃度增大，峰形對稱，分離度增大；但是濃度太高，會降低電滲流，導致樣品出峰時間延長。綜合選擇60 mmol/L 四硼酸鈉-磷酸二氫鉀緩沖液進行后續試驗。較高的緩沖液濃度能適當延長分析物出峰時間，可以增加分離度。加入30%濃度甲醇，可以增大分離度，改善樣品峰型，高于此濃度會增大出峰時間。綜合上述結果，最終選定60 mmol/L 四硼酸鈉-磷酸二氫鉀-30%甲醇作為緩沖液。

圖2 不同緩沖液條件下酸橙樣品色譜圖

圖3 不同緩沖液濃度的影響

2.1.3 分離電壓的選擇 分離電壓對分離度的影響較小，選擇電壓時，主要考察電壓對峰遷移時間、峰形、基線和電流穩定性的影響。試驗結果見圖4，基電壓過低會導致峰形展寬，峰遷移時間過長；隨著電壓增大，峰遷移時間縮短，峰形更加尖銳、對稱。但電壓過大時會造成樣品峰高降低，峰面積減小，樣品分離度下降。這與電壓增大導致電流增大，產生大量焦耳熱等因素有關。綜合考慮后，將最佳檢測電壓定為15 kV。

圖4 不同分離電壓的影響

綜合以上結果，最終確定的電泳條件如下：色譜柱為未涂層標準熔融石英毛細管（64.5 cm×50 μm，有效長度56 cm，安捷倫科技有限公司）；緩沖液為60 mmol/L 四硼酸鈉-磷酸二氫鉀-30%甲醇，pH值（8.3）未經調整；運行電壓15 kV；壓力進樣50 mbar×5 s；柱溫25℃，檢測波長223 nm。每天檢測之前將毛細管分別用水、1 mol/L 氫氧化鈉、超純水、緩沖溶液各沖洗5、5、5、10 min，其中在氫氧化鈉沖洗后靜置5 min，每2 次運行之間僅用緩沖溶液沖洗5 min，多次檢測之后，需更換緩沖液并重新平衡毛細管。在此優化電泳條件下，辛弗林標準品與酸橙樣品的色譜圖見圖5。

圖5 辛弗林標準品、酸橙樣品色譜圖

2.2 線性關系考察

結果表明，在33～530 μg/mL 的濃度范圍內辛弗林的標準曲線回歸方程為Y= 410.87X-3.068 9，相關系數為R2=0.999 9，呈良好線性關系，表明該方法適用于酸橙辛弗林含量測定。

2.3 方法學考察

檢測條件的精密度、重復性、穩定性相對標準偏差（RSD）分別為1.8%、1.7%、2.2%，均小于3.0%，表明優化后的檢測方法有良好的精密度、穩定性和重復性。樣品的加標回收率為93%，RSD 為2.3%，表明回收率良好，方法的準確度良好。

2.4 辛弗林含量測定結果分析

隨機選取5 個酸橙種質，測定辛弗林含量，結果見表1。采收期對酸橙果實中辛弗林含量有顯著性影響（P＜0.05），應該選擇科學的采摘期。隨著采收期的推遲，沅江酸橙的辛弗林含量變化總體呈下降趨勢，從8 月中旬開始，酸橙辛弗林含量無顯著性差異，趨于穩定。根據中國藥典2015 版[3]規定，按干燥品計算，枳實的辛弗林含量不低于3 mg/g，表1 中結果表明6月中旬之前采集的果實辛弗林含量基本都符合藥典規定，因此沅江市的枳實采收時間可定于5 月至6 月中旬。枳殼的采摘應該在7 月中旬到8 月中旬，既能保證藥效含量高，此時期果實的產量也高，采收時間太晚，會導致枳殼果實瓤增大，皮變薄，不僅藥效下降，也會影響后期售賣[11]。

表1 不同采收期酸橙辛弗林含量測定結果 （mg/g）

取5 月18 日采集的第一批21 株酸橙種質進行辛弗林含量測定，以其含量繪制酸橙樣本正態概率分布圖（見圖6），所有樣本基本分布在直線附近，表明酸橙樣品辛弗林含量分布具有正態性，樣品取樣具有代表性。從圖7 可以看出，21 株酸橙種質辛弗林含量為7.64～9.96 mg/g，相同的產地和采收期，不同酸橙種質之間辛弗林含量有顯著差異（P＜0.05），編號為9、21、50、65、77 的5 株酸橙種質辛弗林含量最高，可 為高生物堿特性的酸橙品種選育提供種質資源。

圖6 酸橙樣品正態概率

圖7 不同酸橙樣品的辛弗林含量比較

3 結 論

試驗首先進行了HPCE 電泳條件的優化，在優化后的電泳條件下，酸橙樣品溶液無需進行預富集，可在10 min 內快速出峰，峰形較好，無拖尾，與相鄰組分分離度滿足分離要求，無其他物質雜峰干擾。通過方法學考察，該測定方法可以在較寬的濃度范圍內對酸橙樣品成分進行分析，為酸橙的質量評價提供更多檢測方法，相比于RP-HPLC 檢測簡單快速，成本更低。采用優化后的方法測定沅江酸橙種質中辛弗林含量，結果表明采收期對辛弗林含量影響顯著，應該選擇科學的采摘期，沅江市的枳實采收時間可定于5 月至6 月中旬，而枳殼的采摘應該在7 月中旬到8 月中旬。21 株酸橙種質的含量測定結果表明，相同采收期酸橙辛弗林含量有顯著差異，編號為9、21、50、65、77 的5 株酸橙種質辛弗林含量最高，可為高生物堿特性的酸橙品種選育提供優異的種質資源。