肌肉生長抑制素基因敲除對2型糖尿病小鼠白色脂肪棕色化及相關基因表達的影響研究

程經緯，柳楊青，汪艷芳

肌肉生長抑制素（Mstn）是1997年發現的于骨骼肌中高表達的轉化生長因子β超家族成員之一，又稱為生長分化因子8，其從小鼠骨骼肌cDNA文庫克隆，對肌肉量起負調節作用［1］。除影響肌肉生長分化外，Mstn還具有調節脂代謝的作用。文獻報道，Mstn可在體外抑制前體脂肪細胞的分化；特異性敲除Mstn基因后，高脂或正常飲食喂養的小鼠均表現為脂肪量減少，肌肉量增加［2-3］。本研究觀察Mstn基因敲除的2型糖尿病（T2DM）小鼠白色脂肪棕色化相關基因表達變化，探究Mstn對T2DM小鼠白色脂肪棕色化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 野生型（wild type，WT）小鼠12只，雜合型Mstn基因敲除〔Mstn（+/-）〕小鼠12只，純合型Mstn基因敲除〔Mstn（-/-）〕小鼠12只，SPF級，品系C57BL/6N，6周齡，雄性，由賽業生物科技有限公司提供〔動物實驗許可證號：SCXK（蘇）2020-0006〕。小鼠適應性飼養1周，室內溫度22～24 ℃，濕度40%～60%，保持晝夜12 h節律，自由進食、飲水。本研究實驗過程遵循河南大學實驗動物倫理相關規定，符合3R原則。本實驗時間為2019年1月至2020年1月。

1.2 主要儀器與試劑 AU400全自動生化分析儀（美國Beckman公司）；酶標儀（美國BioTeK公司）；脫水機、包埋機、病理切片機（武漢俊杰電子有限公司）；光學顯微鏡及成像系統（日本Nikon公司）；脫色搖床、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；游離脂肪酸（FFA）酶聯免疫試劑盒、兔抗小鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）、解偶聯蛋白1（UCP1）多克隆抗體（武漢云克隆科技股份有限公司）；兔抗小鼠分化簇137（CD137）多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。

本研究行業貢獻：

目前的肥胖控制手段仍然有限，缺乏治療肥胖和相關代謝性疾病的有效藥物。白色脂肪主要用于儲存熱量，棕色脂肪主要負責產熱。探究白色脂肪向棕色脂肪轉化的調控機制以及對外部刺激的感應機制，有助于開發治療肥胖的新藥物。既往研究表明，肌肉生長抑制素（Mstn）可能調控脂肪代謝。本研究在Mstn基因敲除基礎上構建2型糖尿病（T2DM）小鼠模型，探究Mstn對T2DM小鼠白色脂肪棕色化的影響，發現抑制Mstn基因表達可上調白色脂肪棕色化相關基因表達，促進T2DM白色脂肪棕色化，改善肥胖，為肥胖、T2DM等代謝性疾病的治療提供了新策略及新靶點。

1.3 分組及動物模型構建 將12只WT小鼠、12只Mstn（+/-）小鼠、12只Mstn（-/-）小鼠隨機各分為2組，每組6只，分別為WT組、WT+DM組，Mstn（+/-）組、Mstn（+/-）+DM組，Mstn（-/-）組、Mstn（-/-）+DM組，每組6只，其中WT組、Mstn（+/-）組、Mstn（-/-）組給予普通飲食6周，WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組、Mstn（-/-）+DM組給予高脂飲食6周+STZ誘導構建T2DM模型。WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組、Mstn（-/-）+DM組給予高脂飲食喂養6周后，在不禁食狀態下以50 mg/kg腹腔注射2% STZ（檸檬酸鈉緩沖液配制），72 h后禁食6 h，取尾靜脈血，血糖儀檢測空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出現多飲、多食、多尿、消瘦癥狀，即可認為T2DM模型構建成功。WT組、Mstn（+/-）組、Mstn（-/-）組小鼠腹腔注射等劑量檸檬酸緩沖液。普通飲食：總熱量為13.5 kJ/g，糖類、脂肪、蛋白質分別占66%、10%、24%；高脂飲食：總熱量為18.7 kJ/g，糖類、脂肪、蛋白質分別占28%、56%、16%。

1.4 體質量、體長測定 建模前及建模成功后，用電子秤測定各組小鼠體質量，卷尺測定小鼠體長（鼻尖至肛門的距離），計算Lee's指數=體質量（g）1/3×1 000/體長（cm）。

1.5 血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、FFA水平檢測 各組小鼠禁食6 h后取尾靜脈血0.2 ml，以 3 000 r/min離心5 min，離心半徑12 cm，留取上清液，應用全自動生化分析儀檢測血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平；采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清FFA水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 白色及棕色脂肪質量測定 以上實驗完成后將小鼠斷椎處死，迅速解剖取出小鼠白色脂肪組織（腹股溝、附睪、腸系膜）、棕色脂肪組織（肩胛），吸取表面血液及體液，用電子秤稱濕重。計算白棕比=白色脂肪質量（g）/棕色脂肪質量（g），脂肪指數=（白色脂肪質量+棕色脂肪質量）（g）/體質量（g）。將腹股溝白色脂肪組織及肩胛棕色脂肪組織一半保存于液氮中，一半保存于體積分數4%的中性甲醛溶液中，石蠟包埋固定。

1.7 白色及棕色脂肪組織形態分析 采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察脂肪組織形態。包埋好的白色及棕色脂肪組織標本切成4 μm厚薄片，二甲苯及酒精脫蠟，水洗；蘇木精染液染色5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍，水洗；伊紅染液染色3 min，經梯度酒精及二甲苯脫水透明，中性樹膠封固。脂肪組織切片均于光學顯微鏡下采集圖像，采用Image J軟件分析脂肪組織形態。

1.8 白色及棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量檢測 采用Western-blotting法檢測蛋白表達水平。取脂肪組織50 mg置于勻漿器，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，反復多次勻漿及冰浴以確保完全裂解。將勻漿液轉移至離心管中，以 12 000 r/min 離心 10 min（離心半徑 12 cm）后留取上清液。BCA法配制標準蛋白和待測蛋白，37 ℃孵育30 min，用酶標儀測蛋白濃度，制作標準曲線。裝好潔凈干燥的玻璃板，根據蛋白大小配制分離膠和濃縮膠，分離膠灌至2/3處，40 min后灌入濃縮膠至頂，然后將梳子插入濃縮膠中，盡量避免氣泡產生。靜置10 min后加入電泳液，將樣品緩慢加入電泳孔中，電壓60 V，電泳至溴酚藍到達底部時停止電泳。加入含有甲醇的轉移緩沖液，電壓60 V轉膜2 h，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。質量分數5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h。加入TBST緩沖液稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。加入TBST緩沖液稀釋二抗，室溫下孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。等體積ECLA液、ECLB液混勻，加至PVDF膜，1 min后除凈殘液并放入暗匣中曝光，然后依次放入顯影液及定影液中至膠片透明，晾干，掃描膠片。以β-actin為內參蛋白，采用Image J軟件分析目標條帶的光密度值。

1.9 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 六組小鼠體質量、體長、Lee's指數、白棕比、脂肪指數比較 本研究18只T2DM小鼠模型均構建成功。六組小鼠體質量、體長、Lee's指數、白棕比、脂肪指數比較，差異均有統計學意義（P＜0.001）。其中Mstn（+/-）組白棕比低于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組體質量高于WT組，體長低于WT組、Mstn（+/-）組，Lee's指數、白棕比均低于WT組、Mstn（+/-）組，差異有統計學意義（P＜0.05）；WT+DM組Lee's指數低于WT組，白棕比及脂肪指數高于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（+/-）+DM組白棕比及脂肪指數低于WT+DM組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）+DM組體質量高于WT+DM組，體長長于WT+DM組，Lee's指數及白棕比均低于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，脂肪指數低于WT+DM組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 六組小鼠體質量、體長、Lee's指數、白棕比、脂肪指數比較（±s）Table 1 Comparison of weight，body length，Lee index，white-brown fat ratio and fat mass index in six groups of mice

表1 六組小鼠體質量、體長、Lee's指數、白棕比、脂肪指數比較（±s）Table 1 Comparison of weight，body length，Lee index，white-brown fat ratio and fat mass index in six groups of mice

注：WT=野生型，Mstn=肌肉生長抑制素，Mstn（+/-）=雜合型Mstn基因敲除，Mstn（-/-）=純合型Mstn基因敲除，DM=糖尿病；a表示與WT組相比P＜0.05，b表示與Mstn（+/-）組相比P＜0.05，c表示與Mstn（-/-）組相比P＜0.05，d表示與WT+DM組相比P＜0.05，e表示與Mstn（+/-）+DM組相比P＜0.05

組別 只數 體質量（g） 體長（cm） Lee's指數 白棕比 脂肪指數WT 組 6 27.48±1.16 8.30±0.32 363.84±11.01 3.05±0.09 0.020 7±0.003 8 Mstn（+/-）組 6 29.26±1.55 8.58±0.15 359.19±10.80 2.24±0.12a0.017 7±0.004 1 Mstn（-/-）組 6 31.14±1.71a9.12±0.18ab345.07±12.80ab1.75±0.14ab0.014 9±0.001 5 WT+DM 組 6 22.22±2.29a8.36±0.19 335.95±7.70a 4.33±0.19a0.041 2±0.006 5a Mstn（+/-）+DM 組 6 23.88±1.94 8.76±0.28 334.39±5.31 3.28±0.06d0.025 1±0.004 0d Mstn（-/-）+DM 組 6 24.22±1.70d9.28±0.13d 311.62±4.44de2.13±0.15de0.016 9±0.005 0d F值 19.510 16.621 21.199 259.435 24.230 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 六組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較 六組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.001）。其中Mstn（+/-）組血清TC水平低于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組血清TG水平低于WT組、Mstn（+/-）組，TC水平低于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；WT+DM組血清TG、TC、LDL-C、FFA水平高于WT組，HDL-C水平低于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（+/-）+DM組血清TG、TC、FFA水平低于WT+DM組，HDL-C水平高于WT+DM組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）+DM組血清TG、LDL-C、FFA水平低于WT+DM組，TC水平低于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，HDL-C水平高于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 六組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of levels of serum TG，TC，LDL-C，HDL-C and FFA of in six groups of mice

表2 六組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of levels of serum TG，TC，LDL-C，HDL-C and FFA of in six groups of mice

注：TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，FFA=游離脂肪酸；a表示與WT組相比P＜0.05，b表示與Mstn（+/-）組相比P＜0.05，c表示與Mstn（-/-）組相比P＜0.05，d表示與WT+DM組相比P＜0.05，e表示與Mstn（+/-）+DM組相比P＜0.05

組別 只數 TG TC LDL-C HDL-C FFA WT組 6 1.17±0.06 2.84±0.23 0.36±0.02 0.66±0.04 0.62±0.01 Mstn（+/-）組 6 1.11±0.03 2.45±0.21a 0.37±0.02 0.67±0.03 0.62±0.01 Mstn（-/-）組 6 1.02±0.06ab 2.51±0.05a 0.43±0.13 0.67±0.01 0.61±0.01 WT+DM 組 6 1.62±0.06a 5.13±0.20a 0.50±0.03a 0.38±0.01a 0.78±0.02a Mstn（+/-）+DM 組 6 1.44±0.04d 4.27±0.18d 0.49±0.02 0.44±0.02d 0.72±0.01d Mstn（-/-）+DM 組 6 1.38±0.02d 3.81±0.18de 0.43±0.02d 0.50±0.01de 0.70±0.01d F值 112.663 174.600 31.258 458.253 110.621 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 六組小鼠白色及棕色脂肪細胞形態比較

2.3.1 六組小鼠白色脂肪細胞形態比較 WT組白色脂肪細胞形態飽滿、大小均勻；與WT組相比，Mstn（-/-）組白色脂肪細胞數量明顯增多，體積明顯縮小，形態不規則；Mstn（+/-）組表現介于WT組與Mstn（-/-）組之間。WT+DM組白色脂肪細胞體積較WT組明顯增大，大小不均勻、細胞間有融合；與WT+DM組相比，Mstn（-/-）+DM組白色脂肪細胞數量明顯增多，體積明顯縮小；Mstn（+/-）+DM組表現介于WT+DM組與Mstn（-/-）+DM組之間，見圖1。

圖1 六組小鼠白色脂肪細胞形態比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the morphology of white adipocytes in six groups of mice

2.3.2 六組小鼠棕色脂肪細胞形態比較 WT組、Mstn（+/-）組、Mstn（-/-）組棕色脂肪細胞形態均呈多房樣，未見單泡脂肪細胞；Mstn（-/-）組較WT組、Mstn（+/-）組棕色脂肪細胞分布更密集。WT+DM組可見多房樣棕色脂肪細胞中有大量單泡脂肪細胞分布，細胞中央有一圓形脂滴；Mstn（-/-）+DM組可見多房樣棕色脂肪細胞中散在分布單泡脂肪細胞，與WT+DM組相比數量明顯減少，脂滴體積明顯減小；Mstn（+/-）+DM組表現介于WT+DM組與Mstn（-/-）+DM組之間，見圖2。

圖2 六組小鼠棕色脂肪細胞形態比較（HE染色，×400）Figure 2 Comparison of the morphology of brown adipocytes in six groups of mice

2.4 六組小鼠白色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量比較 六組小鼠白色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。其中Mstn（+/-）組UCP1、CD137蛋白相對表達量高于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組PPAR-γ、PGC-1α、CD137蛋白相對表達量均高于WT組、Mstn（+/-）組，UCP1高于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；WT+DM 組 PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量均低于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（+/-）+DM組CD137蛋白相對表達量高于WT+DM組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組 PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量均高于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 六組小鼠白色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白表達情況Figure 3 Expression levels of PPARγ，PGC-1α，UCP1 and CD137 proteins in white fat of six groups of mice

表3 六組小鼠白色脂肪PPARγ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量比較（±s）Table 3 Comparison of relative expression levels of PPARγ，PGC-1α，UCP1 and CD137 protein in white fat of six groups of mice

表3 六組小鼠白色脂肪PPARγ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量比較（±s）Table 3 Comparison of relative expression levels of PPARγ，PGC-1α，UCP1 and CD137 protein in white fat of six groups of mice

注：PPAR-γ=過氧化物酶體增殖物激活受體γ，PGC-1α=過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α，UCP1=解偶聯蛋白1，CD137=分化簇 137；a表示與 WT組相比 P＜0.05，b表示與 Mstn（+/-）組相比 P＜0.05，c表示與 Mstn（-/-）組相比 P＜0.05，d表示與WT+DM組相比P＜0.05，e表示與Mstn（+/-）+DM組相比P＜0.05

組別 只數 PPAR-γ PGC-1α UCP1 CD137 WT 組 6 0.879±0.016 0.705±0.012 0.236±0.020 0.081±0.002 Mstn（+/-）組 6 0.908±0.112 0.711±0.023 0.767±0.069a 0.111±0.004a Mstn（-/-）組 6 1.108±0.026ab 0.926±0.076ab 0.800±0.049a 0.129±0.003ab WT+DM 組 6 0.170±0.005a 0.189±0.012a 0.073±0.001a 0.025±0.002a Mstn（+/-）+DM 組 6 0.190±0.010 0.173±0.010 0.095±0.010 0.060±0.002d Mstn（-/-）+DM 組 6 0.348±0.009de0.311±0.008de0.165±0.008de0.104±0.008de F值 446.360 539.281 528.637 538.335 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量比較 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。其中Mstn（+/-）組PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量均高于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）組PPAR-γ、PGC-1α、CD137蛋白相對表達量均高于WT組、Mstn（+/-）組，UCP1高于WT組，差異有統計學意義（P＜0.05）；WT+DM組PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量均低于WT組（P＜0.05），差異有統計學意義；Mstn（+/-）+DM組PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量均高于WT+DM組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Mstn（-/-）+DM組PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量均高于WT+DM組、Mstn（+/-）+DM組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4、圖4。

圖4 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白表達情況Figure 4 Expression levels of PPAR-γ，PGC-1α，UCP1 and CD137 proteins in brown fat of six groups of mice

表4 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量比較（±s）Table 4 Comparison of relative expression levels of PPAR-γ，PGC-1α，UCP1 and CD137 protein in brown fat of six groups of mice

表4 六組小鼠棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量比較（±s）Table 4 Comparison of relative expression levels of PPAR-γ，PGC-1α，UCP1 and CD137 protein in brown fat of six groups of mice

注：a表示與WT組相比 P＜0.05，b表示與 Mstn（+/-）組相比P＜0.05，c表示與 Mstn（-/-）組相比 P＜0.05，d表示與 WT+DM 組相比P＜0.05，e表示與Mstn（+/-）+DM組相比P＜0.05

組別 只數 PPAR-γ PGC-1α UCP1 CD137 WT 組 6 1.359±0.060 0.929±0.008 0.658±0.038 0.079±0.002 Mstn（+/-）組 6 1.920±0.050a 1.111±0.050a 0.809±0.017a 0.152±0.009a Mstn（-/-）組 6 2.052±0.040ab1.556±0.059ab 0.830±0.030a 0.273±0.016ab WT+DM 組 6 0.301±0.014a 0.187±0.011a 0.092±0.007a 0.062±0.003a Mstn（+/-）+DM 組 6 0.455±0.027d 0.251±0.020d 0.129±0.006d 0.130±0.006d Mstn（-/-）+DM 組 6 1.218±0.085de0.645±0.014de0.288±0.010de0.168±0.004de F 值 1 196.913 1 463.654 1 493.055 490.418 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

越來越多的研究發現Mstn在脂肪生長、分化、代謝中發揮重要作用，參與肥胖的發生。有研究結果顯示，Mstn（-/-）小鼠與WT小鼠相比脂肪含量明顯減少，血清TG、FFA水平明顯降低［4-5］。Mstn（-/-）梅山豬皮下脂肪含量與體質量的比例、血清TG水平明顯低于WT［6］。本研究結果顯示，Mstn（-/-）組Lee's指數、血清TG、TC水平低于WT組；WT+DM組Lee's指數、HDL-C水平低于WT組，脂肪指數和血清TG、TC、LDL-C、FFA水平高于WT組；Mstn（-/-）+DM組Lee's指數、脂肪指數和血清TG、TC、LDL-C、FFA水平低于WT+DM組，HDL-C水平高于WT+DM組。Lee's指數反映小鼠肥胖程度，脂肪指數反映小鼠體內脂肪量，而血清TG、TC、LDL-C、FFA水平升高，HDL-C水平降低是機體脂代謝紊亂的特征性生化改變，上述結果提示敲除Mstn基因后可明顯拮抗T2DM引起的脂肪堆積、脂代謝紊亂等肥胖表征。Mstn（-/-）小鼠脂肪量減少可能與Mstn抑制前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化有關。在脂肪組織形成初期，前體脂肪細胞由于解除了Mstn的抑制，分化能力增強，提前發育成熟，從而無法繼續分裂增殖，成熟脂肪細胞數量減少，導致脂肪總量減少［3］。

脂肪主要分為白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪。白色脂肪組織主要分布于皮下和腸系膜、生殖腺等內臟周圍，白色脂肪細胞包含單個較大脂滴，含有大量TG，主要作用為儲存機體多余的能量，是導致肥胖的主要因素；棕色脂肪組織主要分布在肩胛，棕色脂肪細胞包含多房小脂滴，胞內含有大量線粒體，以非偶聯氧化磷酸化的方式消耗白色脂肪儲存的TG，產生熱量，調節體溫平衡；米色脂肪主要分布在白色脂肪組織間，屬于白色脂肪向棕色脂肪轉化的中間形態，可于寒冷等外界刺激后被激活，發揮類似棕色脂肪的產熱功能，即發生了白色脂肪棕色化［7］。棕色和米色脂肪均可改善機體脂肪代謝、減輕肥胖，其細胞內均存在高表達的標志性基因。研究證實，PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、PR結構域蛋白16（PRDM16）、誘導細胞死亡DNA片段化因子α樣效應因子A（Cidea）在棕色脂肪細胞中高表達，CD137、跨膜蛋白26（Tmem26）在米色脂肪細胞中高表達，以上基因均是白色脂肪棕色化的標志物［8-10］。PPAR-γ是一種核激素受體，是體內脂肪形成必需的轉錄因子，在調控脂肪細胞分化中發揮重要作用［11］。PGC-1α受上游信號分子PPAR-γ調控，調節線粒體電子傳遞鏈以及氧化呼吸功能，進一步調節棕色脂肪組織的產熱作用［12］。UCP1是一種線粒體內膜蛋白，可以消除線粒體內膜兩側由質子濃度差形成的電勢差，阻礙線粒體呼吸鏈的傳遞，抑制三磷酸腺苷的產生，將儲存的能量轉化為熱量，維持體溫平衡［13］。CD137是腫瘤壞死因子受體家族成員之一，是米色脂肪區別于其他脂肪細胞的特異性標志物［14］。通過檢測上述基因表達，可反映白色脂肪棕色化的程度。

Mstn可調控白色脂肪棕色化。研究發現，Mstn（-/-）小鼠白色脂肪出現棕色脂肪的表型，能量利用增加，可抵抗遺傳性或飲食誘導的肥胖，且皮下白色脂肪組織PGC-1α、UCP1、CD137及Tmem26基因表達均升高［4］。Mstn（-/-）梅山豬背部皮下白色脂肪組織中單室大脂滴細胞數量減少，多房小脂滴細胞數量增加，脂肪 組 織 PGC-1α、PRDM16、Cidea、CD137、Tmem26基因表達均上調，提示白色脂肪棕色化趨勢明顯增強［6］。本研究結果顯示，Mstn（-/-）組白棕比低于WT組，WT+DM組白棕比高于WT組，Mstn（-/-）+DM組白棕比低于WT+DM組；HE染色觀察到Mstn（-/-）組較WT組白色脂肪細胞體積明顯縮小，數量明顯增多，從形態上有向棕色脂肪細胞轉化的趨勢，WT+DM組白色脂肪細胞體積較WT組明顯增大，棕色脂肪細胞間分布大量圓形單房脂滴，而Mstn（-/-）+DM組上述病理改變較輕，表明抑制Mstn表達可抑制T2DM引起的脂肪細胞體積增大，誘導白色脂肪出現棕色脂肪細胞表征。本研究進一步檢測了棕色脂肪標記基因PPAR-γ、PGC-1α、UCP1，米色脂肪標記基因CD137在脂肪組織中的表達，結果顯示，Mstn（-/-）組白色脂肪及棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量均高于WT組，WT+DM組均低于WT組，Mstn（-/-）+DM組高于WT+DM組，結合白色及棕色脂肪組織HE染色，提示T2DM可誘導棕色脂肪及米色脂肪標志性基因表達減少，白色脂肪表型增加，能量儲存過剩，而敲除Mstn基因后可明顯拮抗此現象，上調棕色脂肪及米色脂肪標志性基因表達，促進白色脂肪棕色化，增加機體產熱，促進白色脂肪消耗，減輕肥胖。分析其具體機制，可能與Mstn缺失通過下調miR-34a促進Ⅲ型纖連蛋白結構域包含蛋白5（FNDC5）/鳶尾素（irisin）表達有關［15］。FNDC5是irisin的前體蛋白，主要由骨骼肌分泌，可通過血液循環進入脂肪組織中，促進白色脂肪棕色化，消耗白色脂肪，減少脂肪沉積［6］。也有研究發現，Mstn可調控Smad3介導的β-連環蛋白表達抑制棕色脂肪細胞分化［16］。

本研究結果顯示，Mstn（+/-）+DM組白棕比、脂肪指數、血清TG、TC及FFA水平低于WT+DM組，白色脂肪CD137及棕色脂肪PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137蛋白相對表達量高于WT+DM組，HE染色顯示Mstn（+/-）+DM組白色及棕色脂肪細胞形態介于WT+DM組與Mstn（-/-）+DM組之間，表明部分抑制Mstn表達可在一定程度上拮抗T2DM引起的白色脂肪增多、米色/棕色脂肪減少及脂代謝紊亂的表現。

本研究結果提示，抑制Mstn基因表達可拮抗T2DM引起的白色脂肪堆積、脂代謝紊亂等肥胖表型，上調PPAR-γ、PGC-1α、UCP1、CD137基因表達，促進白色脂肪棕色化，為T2DM、肥胖、肌少癥等代謝性疾病的防治提供理論依據。本研究不足之處在于樣本量較小，也未進行下游分子機制研究，因此結論有一定局限性，Mstn參與白色脂肪棕色化的具體機制需進一步研究證實。

作者貢獻：程經緯負責實驗設計與實施，數據收集與統計學分析，論文的構思、設計、撰寫；柳楊青負責實驗設計與實施，論文修訂；汪艷芳負責研究選題，實驗的監督管理，論文的質量控制及審校，對論文整體負責。

本文無利益沖突。