基于文獻分析我國營養繁殖類藥用植物病毒檢測及脫毒復壯研究現狀

田 晨，王 冉，段永波

(淮北師范大學 a.生命科學學院，b.安徽省特色資源植物利用工程實驗室，安徽 淮北 235000)

中草藥植物資源維持著全球超過80%的人口尤其是發展中國家人民的身體健康[1]。然而，野生資源難以滿足市場需求，且當前僅有0.94%的藥用植物以大田栽培為主[2]。天然條件下，很多藥用植物不選擇有性生殖途徑，這使后代能較好地獲得母體的遺傳性狀，特別是活性成分的穩定[3]。病毒病已成為營養繁殖類藥用植物生產的主要限制因素之一[4]，使用無病毒繁殖材料是這類植物生產的重要保障。

植物病毒是非細胞形態的生命體，以全寄生方式生存于寄主植物，有“植物癌癥”之稱[5]。自從在馬鈴薯和草莓等作物中成功應用以來，脫毒培養已廣泛應用于藥用植物研究[6]。然而，關于藥用植物脫毒培養的研究大部分都局限于實驗室階段，真正大規模應用的極少[7]。相比于生殖生長的植物來講，病毒病對營養繁殖類藥用植物的危害更為嚴重[8]，但目前此類植物感染病毒及脫毒研究的現狀尚不清楚。

文獻計量分析可很好地反映相關領域研究概況，提供有確切數字的有力背景資料[9]，為后續研究提供參考。本文以相關文獻為研究對象，統計分析了發文量、病毒感染種類、脫毒方法及病毒檢測技術等指標，并就相關研究熱點及研究前景進行了展望，以期為加速該類植物脫毒材料規模化應用提供思路。

1 研究資料與方法

1.1 研究資料

本文選取市場用量極大的30種營養繁殖類(或能生殖生長但以營養繁殖為主)藥用植物的文獻為研究對象。植物種類如下：百合、半夏、薄荷、貝母、大蒜、大棗、丹參、地黃、枸杞、紅花、菊花、葡萄、月季、桃、靈芝、龍眼、蘆薈、羅漢果、馬錢子、麥冬、枇杷、人參、山藥、山楂、生姜、石斛、太子參、唐菖蒲、玄參和桑。

1.2 方法

1.2.1 文獻調研

在中國知網(CNKI)(http://www.cnki.net/)輸入關鍵詞“某植物+病毒/脫毒”，在Web of Science(WOS)(http://www.webofscience.com/)輸入“plant name + virus/virus elimination ”搜索1987—2020年的相關文獻，瀏覽各篇文獻摘要，剔除綜述和新聞報道類，建立相關數據庫。

1.2.2 歸納分析法

根據所建立的數據庫，統計不同年份中文和英文文獻發文量、病毒種類及研究內容。對脫毒方法、病毒檢測方法和脫毒效果進行歸納總結，進而分析我國營養繁殖類藥用植物病毒檢測及脫毒復壯研究現狀。

2 結果與分析

2.1 發文量

共檢索到有關文獻222篇，其中CNKI數據庫文獻202篇，WOS 20篇。在CNKI文獻中，對百合[10]、大蒜[11]、菊花[12]和生姜[13]的脫毒研究較多，而有關桑、玄參、銀杏等植物的研究較少。WOS文獻關于百合、大蒜、菊花這3種植物的研究較多，少數涉及山藥和桃等。

從圖1可以看出，1987—2009年的發文量總體呈逐漸上升趨勢。2002年前發文量較少，2002—2009年，中文文獻快速增加，這些文獻大多聚焦在既屬藥用又具其他價值的植物，表明這期間的脫毒研究可能更關注其食用和觀賞等方面價值。之后CNKI發文量呈現下降趨勢，WOS發文量有小幅度增加。分析原因，可能因部分藥用兼具其他功能植物的脫毒技術逐漸發展成熟，而對僅有藥用功能植物的關注有所減少[14]，也可能與研究水平逐漸提高將研究成果發表于英文雜志有關。

2.2 病毒種類及研究內容分類

按植物種類將相關文獻分類，統計各自文獻總數及病毒種類(表1)。其中百合、大蒜、生姜、菊花文獻數較多，分別為33、43、30和23篇，而大棗、紅花、靈芝、蘆薈等植物文獻較少，各僅有1篇。藥用植物感染的病毒包括黃瓜花葉病毒(CMV)、大蒜潛隱病毒(簡稱GLV)、煙草花葉病毒(TMV)、韭蔥黃條病毒(LYSV)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯M病毒(PVM)等。按照研究內容統計，關于脫毒方法的文獻最多，除枸杞、麥冬、玄參之外的其他植物均涉及到脫毒方法，其次是病毒檢測技術研究，還有部分涉及脫毒材料的田間試驗。百合、大蒜等植物的研究文獻雖然較多，但主要集中在脫毒方法優化方面，關于病毒檢測技術和田間試驗的文獻均低于10%，而靈芝、大棗等重要藥用植物還未有病毒檢測技術和田間試驗方面的研究。麥冬和玄參的文獻雖然只有1～2篇，但都是報道其田間試驗，這也從側面反映了生產上對于脫毒材料的迫切需求。

2.3 脫毒方法分析

脫毒方法主要包括莖尖培養脫毒、熱處理結合莖尖培養脫毒、病毒唑結合莖尖培養脫毒、化學法、微生物法(表2)。涉及莖尖培養的脫毒文獻研究占總文獻的87%。莖尖為植物幼嫩器官，未受到病毒感染，能快速實現植株脫毒[15]，是研究的首選外植體。由于部分病毒難以脫除及植物同時感染多種病毒等問題，基于莖尖培養又發展出了熱處理結合莖尖培養脫毒[16]、莖尖培養結合病毒唑脫毒[17]等與其他理化手段結合等綜合處理法，進而達到脫毒的目的。

此外，部分植物脫毒研究中還使用了微生物法脫毒、化學法脫毒[18]、物理法脫毒[19]、基因編輯技術[5]或者超低溫脫毒技術[20]等。這些技術為上述常用手段的重要補充，也是未來脫毒方法研究的新方向，有助于保持本品種的遺傳特性，提高繁殖系數，保證營養繁殖類藥用植物的安全生產。

表1 感染病毒種類及研究主題分類占比

表2 脫毒方法的使用情況

表3 病毒檢測方法的使用情況

2.4 病毒檢測方法分析

常用的營養繁殖類藥用植物病毒檢測方法包括電鏡、RT-PCR、酶聯免疫吸附(ELISA)和指示植物法。其中，ELISA使用頻率最高，達到45.04%，其后依次為RT-PCR法、電鏡檢測法和指示植物法(表3)。ELISA法是抗原和抗體免疫反應和酶的高效催化反應有機結合起來的一種綜合性技術，靈敏度高，測定速度快，且能同時測定多個樣品。當前基于ELISA法的病毒檢測以試紙為載體，操作簡單易行，因此成為最主要的檢測方法。部分研究還使用了雙鏈RNA電泳技術、血清學方法以及環介導等溫擴增技術等，為病毒脫毒效果的檢測提供更為準確的數據。

表4 危害植物較嚴重的病毒種類情況

表5 脫毒效果情況分析

2.5 植物病毒分布情況

由表4可知，危害植物較嚴重的病毒有黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(TMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、百合無癥病毒(LSV)以及番茄不孕病毒(TAV)等。其中研究感染CMV的文獻有65篇，占總文獻數的32.2%，分布植物種類有11種，包括百合、半夏、薄荷、貝母、丹參、地黃、枸杞、菊花、紅花、山藥、羅漢果。涉及TMV的文獻44篇，分布于貝母、菊花、大蒜、半夏、地黃等5種植物。涉及PVY的藥用植物所占文獻較少，僅有8篇，分布藥用植物種類包括菊花、山藥、枸杞等3種。CMV、TMV和PVY等病毒侵染植物后能造成花葉、皺縮、條紋等肉眼可見表型，因此受到更多關注，而對于LSV等感染后表型不太明顯的病毒研究則較少。

2.6 脫毒效果分析

如表5所示，百合、生姜、大蒜、地黃和菊花涉及文獻中報道脫毒效果的文獻數都大于6篇，而貝母、紅花、桃和桑的研究文獻相對較少，都只有1～2篇。研究文獻較多的植物感染病毒情況也更為復雜，如大蒜感染病毒種類達到19種，脫毒效果在85%～100%。而貝母、紅花等植物脫毒效果徹底，均達到了100%，與這些植物感染病毒種類較少，也可能與部分植物能進行生殖生長而減輕病毒感染有關。另外，有的文獻雖然沒有記載具體的脫毒成功率，但用于高產栽培技術研究，也間接證實了較好的脫毒效果。

3 討 論

3.1 關于藥用兼具其他功效的植物研究較多，而單一藥用價值的植物較少

百合、生姜、大蒜和菊花這4種植物的脫毒文獻較多，其中大蒜的文獻最多，共43篇，占19.37%。大蒜受氣候、種植等方面的限制，會加重病毒的感染[21]。大蒜的脫毒研究極多，可能更主要是由于其食用價值需求，推動脫毒材料應用于田間生產[22]。從兩大數據庫共檢索到百合脫毒培養的文獻33篇，占14.86%。百合不僅藥用價值高，還是重要的花卉，具有較高的觀賞價值[23]。生姜文獻共30篇，占13.51%，生姜可作為藥、食、加工等經濟作物，是我國重要的外貿產品[12]。菊花具有藥用、食用及觀賞價值，檢索到文獻共23篇。然而，地黃、丹參等脫毒研究主要集中在實驗室[24]，僅少量應用于田間。地黃是單一藥用的多年生草本植物，盡管為大宗常用中藥材[25]，但相關文獻較少，占比僅為1%～6%，且研究方法較為單一。此外，如唇形科鼠尾草屬多年生草本植物丹參[26]，具很高的藥用價值，以人工栽培為主，亟待加速脫毒材料的田間使用。

大田作物草莓和馬鈴薯的脫毒技術發展已較為成熟，采用莖尖脫毒和熱處理加莖尖脫毒使得田間規模化生產中無病毒苗比率達到80%～95%[27]。而藥用植物中的營養繁殖類植物的研究則極為滯后，需加快研究進程，促進脫毒材料的田間推廣。

3.2 文獻研究涉及最多的是脫毒方法，但病毒檢測方法正成為研究熱點

發表的文獻對脫毒方法的研究頗多[28]，但大部分以傳統方法為主，耗時久，脫毒效果不明顯，而且少數病毒并不能徹底脫除。目前使用最多的脫毒方法是莖尖脫毒培養法[29]，綜合使用頻率為45.65%，但該方法對于某些病毒的脫毒效果不理想。采用多種脫毒方法相結合可獲得更好的脫毒效果[30]。脫毒技術提高了藥用植物的產量和品質[31]，但還存在很多瓶頸和問題。采用多種脫毒方式結合可利用各自優點，更好地脫除“頑固”病毒[32]，將是藥用植物脫毒研究的重要方向。

病毒檢測方法中，ELISA檢測方法使用頻率最高，為45.04%。此方法敏感性好，特異性高[33]，但需要特異性抗體，且在檢測多種病毒時靈敏度降低，出現“假陽性”[34]，可能干擾田間規模化生產脫毒苗的脫毒質量。分子生物學技術可精準地對病毒感染情況作出檢測[35]，但需進行基因組DNA提取和PCR擴增等，程序較為復雜。因此，發展簡單易行的DNA提取方法及高通量PCR擴增技術對于加快藥用植物脫毒效果的分子檢測意義重大。

3.3 藥用植物脫毒的分子機制還待進一步深入

植物病毒病害是危害農業的第二大病害，但脫毒方法均難以實現脫毒的精準控制。對于莖尖培養法，由于莖尖很小，實際操作中有一定的誤差，因此該種方法常常和其他脫毒方式相結合[36]。熱處理法中，病毒比植物耐熱能力差，但只能殺死部分病毒，并且對于脫毒植物本身的耐受溫度要求比較高[37]。在病毒唑結合莖尖培養法中，莖尖長度對植物莖尖脫毒率的影響最大，而病毒唑質量濃度則影響莖尖成活率[38]。化學法脫毒易于分化出苗，提高存活率，但化學試劑可能會對環境造成危害。超低溫脫毒成功案例少，超低溫處理引起的表觀遺傳現象等尚需進一步研究[39]。花藥培養脫毒法降低了脫毒苗生產成本，但與莖尖分生組織培養相比，培養周期長，不利于快速繁殖。當前使用的脫毒方法各有優缺點，其根本原因在于未能掌握植物病毒脫除的分子機制。新近研究揭示了干細胞重要調控基因WUS在免疫病毒中的關鍵作用[40]，揭示了植物莖頂端分生組織存在廣譜抗病毒免疫的分子機制，為精準高效地實現營養繁殖藥用植物的脫毒提供了新思路。