烯醇化酶-1在口腔鱗狀細胞癌患者唾液和組織中的表達研究

鄭凱月，張倩雨，馬瑩，賀嬋娟，喻潔，劉英，

(1.川北醫學院口腔醫學系，四川 南充 637000；2.中國人民解放軍32081部隊，北京 100000；3.四川省總工會成都工人療養院，四川 成都 610000；4.川北醫學院附屬醫院口腔科，四川 南充 637000)

口腔癌是口腔頜面部最常見的疾病之一，發病率較高。在全身惡性腫瘤中居第六位，其中約90%為口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinom，OSCC)。此外，頜面部淋巴結和血供豐富，使口腔鱗癌易發生遠處轉移。手術加放化療雖然能有效切除病灶，防止疾病復發，但預后較差，中晚期患者的5年生存率僅為30%～40%[1]，患者術后外觀嚴重受損，對語言、吞咽等功能也有非常嚴重的影響。

隨著分子生物學檢測技術的進步，人們發現腫瘤組織能自身產生并分泌許多特異性物質，不僅在腫瘤組織中特異性高表達，而且被腫瘤細胞分泌到周圍環境中，或隨著血液循環分布在唾液、血液、尿液等體液中，這些物質被稱為腫瘤標志物。越來越多的科學家開始嘗試檢測體液中特異性腫瘤標志物的變化，從而達到早期診斷和治療惡性腫瘤的目的。唾液有類似血清的成分，包括水、無機鹽、有機化合物、蛋白質、激素等。有研究者[2]提示，唾液和血清一樣，一般可以作為疾病監測和檢測的介質，檢測結果可以反映疾病的某些過程和狀態。唾液作為OSCC生長的外部液體環境，也存在于腫瘤細胞自身的代謝分泌物中。因此，唾液中OSCC標記物的含量可能比血清中OSCC標記物的含量更為敏感和特異[3-4]。此外，由于其易獲取、無創、患者易接受、可重復采集、易于保存等優點，尋找唾液中OSCC標記物已成為近年來的研究熱點。

糖代謝是腫瘤細胞快速生長和增殖的主要物質和能量來源。在1924年，Warburg提出了著名的“Warburg效應”，即在氧氣充足的條件下，腫瘤細胞仍然主要通過糖酵解而不是線粒體氧化磷酸化來進行糖代謝[5-7]，腫瘤糖酵解酶的異常是近年來的研究熱點。烯醇化酶是糖酵解過程中的關鍵酶，在許多生理過程中起著至關重要的作用，可用作疾病診斷和預后的相關因素或某些感染和癌癥的靶向治療靶點[8-10]。它分為α、β和γ三種亞型，參與組織的特異性表達。烯醇化酶-α(ENO-1)在細胞質中主要起糖酵解酶，在糖酵解過程中，形成同型二聚體或異型二聚體，催化PGA脫水形成PEP，也催化PEP水合合成PGA[11-13]。目前研究[14-18]表明，ENO-1與體內不同腫瘤(如非小細胞肺癌、胰腺癌等)的發生發展密切相關。Bag等[19]發現，ENO-1在口腔鱗狀癌前病變口腔黏膜下纖維化(OSF)患者中高表達，首次證實且驗證ENO-1可作為OSF癌前早期診斷的生物標志物。此外，Ito等[20]研究表明，ENO-1產物亞細胞定位的差異可能與OSCC的發生密切相關。因此，本研究將進一步探討ENO-1在OSCC發生發展中的作用及在OSCC患者唾液和組織中的表達變化之間的關系，從而確定唾液中ENO-1檢測在OSCC患者能否替代組織學檢測，成為OSCC早期診斷的生物標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗組織及唾液標本均來自川北醫學院附屬醫院口腔頜面外科住院部，病理診斷明確。以2014年至2016年高、中、低分化的OSCC患者各15例為實驗組，15例口腔頜面部黏膜組織正常的患者(非腫瘤手術患者)為對照組，行免疫組織化學(IHC)檢測。采集2015年至2016年20例OSCC患者的唾液樣本作為實驗組，正常人(來自無全身性疾病的OSCC患者健康家庭成員)唾液作為正常對照組，唾液樣品在4 ℃，12 000 rmp離心10 min后取上清，裝于1.5 mL無酶EP管中行ELISA檢測。收集16例未壞死的口腔鱗癌組織為實驗組，以癌旁正常組織為對照組，進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot(WB)分析，組織樣品收集在1.5 mL無酶EP管中，置于-80 ℃冰箱。本研究獲院倫理委員會批準(批準號：2021ER(A)034)，所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色(IHC) 免疫組化SP法檢測ENO-1蛋白。標本組織經石蠟包埋、切片后，于60 ℃下溶蠟1 h后，用環保透明劑脫蠟、梯度乙醇水化，然后用檸檬酸進行抗原修復。然后將其與ENO-1兔多克隆抗體(1∶200)在4 ℃孵育過夜，用PBS洗滌3次后，在37 ℃中二次孵育1 h，用DAB顯色法顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，透明環保劑脫水，中性樹膠封片。免疫組化染色評價：采用雙盲法對染色結果進行判定，根據陽性細胞比例和染色強度進行ENO-1表達的半定量分析，顯微鏡(4×10)下觀察切片計算陽性細胞表達數占總細胞數的百分比，其中：0分(0%)；1分(0%～25%)；2分(25%～50%)；3分(50%～75%)；4分(75%～100%)。在20倍顯微鏡下隨機選取5個不同視野計算細胞染色強度，取5個視野得分的平均值作為該切片的最終得分，其中：0分(陰性)、1分(淺黃色)、2分(黃色或深黃色)、3分(深褐色)，兩個積分結果相加得出綜合評分：0分為陰性；1～3分為弱陽性；4～5分為陽性；6～7分為強陽性。

1.2.2 蛋白質印跡分析(WB) 將上述冰凍的OSCC腫瘤及癌旁正常組織磨碎，加入適量蛋白裂解液充分裂解，震蕩離心后，取上清液作為所需蛋白提取物，用BCA試劑盒進行蛋白定量，用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜，含5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，ENO-1兔多克隆抗體(1∶5 000)和內參GAPDH抗兔多克隆抗體(1∶3 000)在4 ℃脫色搖床孵育過夜，TBST膜洗滌3次，每次10 min，二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，TBST膜洗滌10 min ×3次，ECL顯影劑處理后，PVDF膜曝光、成像；利用Image J軟件檢測蛋白條帶的吸光度值，用目的蛋白條帶的吸光度值與內參蛋白條帶的吸光度值之比表示目的蛋白的表達水平。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 在96孔板中依次加入50 μL標準蛋白和50 μL待測樣品，每孔板中加入50 μL雞尾酒溶液，貼封膜于室溫下將孔板置于400 rpm搖床上避光孵育1 h，用1×沖洗緩沖液PT沖洗每個孔3次。洗滌后倒去多余液體，向每個孔中加入100 μL TMB底物顯色劑，并在室溫下400 rpm搖床上避光孵育10 min。每孔加入100 μL終止液，輕輕震蕩1 min將其混勻，將孔板放入在全波長自動酶標儀中，記錄450 nm下的OD值。

1.2.4 RNA提取和定量實時PCR(qRT-PCR) 用組織剪將OSCC腫瘤及癌旁組織剪成糊狀。采用Trizol法提取RNA，檢測總RNA的濃度和純度，A260/280的總RNA純度1.8～2.0為合格。根據逆轉錄試劑盒說明書中描述的反應體系和反應條件進行cDNA的合成。那么,用逆轉錄合成的2 μL cDNA進行q-PCR，以β-actin作為內源對照，使不同樣本總RNA量的差異標準化。對每個樣品重復三個孔，并進行了3次獨立實驗。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 正常黏膜及OSCC腫瘤組織中ENO-1的表達

IHC評分結果顯示，ENO-1主要在細胞質中表達，在正常黏膜組織中呈弱陽性，細胞呈淡黃色，在OSCC腫瘤組織中呈陽性表達，細胞呈明顯的黃色或棕黃色。ENO-1在OSCC腫瘤組織中的表達水平高于正常組織(1.32±0.54)，差異有統計學意義(P<0.001)，而在高(4.00±1.15)、中(3.91±0.62)和低(3.69±0.93)分化的不同病理分級的OSCC腫瘤組織中，ENO-1的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 qRT-PCR檢測正常黏膜及OSCC腫瘤組織中ENO-1 mRNA的表達

OSCC組織中ENO-1的mRNA表達低于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 WB檢測正常黏膜及OSCC腫瘤組織中ENO-1蛋白的表達

結果顯示，ENO-1蛋白在口腔鱗癌組織中的表達(2.10±0.90)高于正常組織(0.71±0.26)，差異有統計學意義(P<0.001)。見圖3A-3B。

2.4 ELISA檢測正常人及OSCC唾液中ENO-1蛋白的表達

ELISA的結果與ENO-1在OSCC和癌旁正常組織中的蛋白表達相似。OSCC腫瘤患者唾液中ENO-1蛋白的表達(220.57±51.93)高于正常人(148.96±19.56)，差異有統計學意義(P<0.001)，說明OSCC腫瘤患者與正常人的唾液中ENO-1表達的差異可能與OSCC的發生發展有關。見圖3C。

2.5 OSCC組和正常組唾液中ENO-1蛋白表達與組織學變化的相關性

WB結果顯示，ENO-1在OSCC腫瘤組織中的蛋白表達高于癌旁組織，提示ENO-1在口腔鱗癌組織中的表達變化可能與口腔鱗癌的發生發展有關。同時， ENO-1在OSCC患者和正常人群組織中的蛋白表達變化與ELISA法檢測的唾液中的變化相似。相關分析顯示，ρ=0.75，P=0.001，說明OSCC組和正常組唾液中ENO-1的表達水平與其組織中的變化密切相關。見表2。

表2 OSCC患者與正常人唾液及組織中ENO-1表達的相關性

3 討論

腫瘤的發生發展是一個復雜的過程，其中基因突變、環境改變、自噬和細胞代謝異常與腫瘤的發生、遷移和侵襲密切相關[21-22]，但其發病機制尚不清楚。相關研究表明，糖酵解是腫瘤細胞生存的重要能量來源，ENO-1是重要的糖酵解酶，所以人體內ENO-1含量的差異可作為腫瘤發展的標志之一。目前，臨床上用于檢測腫瘤標志物的樣本主要來自血液和組織，但這兩種樣本采集方法都存在一定的局限性。首先，樣本采集方法會對患者造成不同程度的創傷，采集過程復雜；其次，樣本采集過程中容易引起醫源性感染；其三，血液和組織檢測結果一般需要患者等待一定時間。與組織和血液樣本不同，唾液無論生理或病理條件如何，都會24 h在人體口腔中分泌。唾液采集方便，無創，成本低，便于重復采集。此外，不受時間、地點和其他客觀條件的限制。

在本研究中，ENO-1在正常人和OSCC患者的唾液和組織中成功表達。ENO-1蛋白在OSCC腫瘤組織中的表達高于癌旁組織(P<0.0001)，但在不同病理分級的OSCC組織中表達差異不明顯。同時，OSCC患者唾液中ENO-1蛋白的表達與正常人有明顯性差異。相關分析顯示，ENO-1在OSCC患者和正常人唾液中的差異表達與OSCC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中的差異表達有顯著相關性(ρ=0.75，P<0.001)。

qRT-PCR結果顯示，ENO-1 mRNA在OSCC組織中的表達低于癌旁組織，與WB結果相反，可能是由于ENO-1 mRNA和蛋白在OSCC組織中的表達趨勢不同，其機制有待后期進一步探討。即便如此，本研究表明，ENO-1在OSCC組織和正常組織中的表達差異，提示ENO-1可能參與了OSCC的發生發展，在未來可作為篩查OSCC的生物標志物。此外，唾液中ENO-1表達的差異與組織中ENO-1表達的差異密切相關，提示檢測唾液中ENO-1含量可作為組織學檢測的替代方法，在OSCC早期作為一種簡便、無創、快速的組織學檢測方法。然而，唾液也有其一定的局限性：它的蛋白質含量低于血液和組織中的蛋白質含量。因此，檢測ENO-1在唾液中的表達需要一種靈敏且高度特異的實驗方法。